STAT3反義寡核苷酸治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的研究.pdf

1、研究目的和背景 克羅恩病(CD)的病因尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，CD發(fā)病時，腸粘膜免疫功能異常，炎癥腸粘膜固有層單個核細(xì)胞(LPMC)異常激活、激活的LPMC對激活后細(xì)胞凋亡(AICD)抵抗，導(dǎo)致炎癥持續(xù)。炎癥腸粘膜有大量的炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，如TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-2等，這些細(xì)胞因子能激活炎癥細(xì)胞內(nèi)的炎癥信號分子，如NF-κB和STAT等，這些信號分子在細(xì)胞核內(nèi)與炎癥分子基因的啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)炎癥分子的表達(dá)。抑制上述

2、炎癥分子機(jī)制的正反饋，對相關(guān)疾病具有一定的治療作用。最近臨床研究發(fā)現(xiàn)，作為IL-6的炎癥細(xì)胞內(nèi)信號分子STAT3，可能參與了CD的發(fā)病機(jī)制。 CD發(fā)病時，腸粘膜T細(xì)胞異常激活，這些激活的T細(xì)胞對AICD存在抵抗。T細(xì)胞抵抗AICD與IL-6有關(guān)，使用針對IL-6受體的抗體，在細(xì)胞外阻斷IL-6與IL-6受體結(jié)合，能誘導(dǎo)炎癥腸粘膜T細(xì)胞發(fā)生凋亡，最近臨床研究證實(shí)，該抗體對CD可能有一定的治療效果。STAT3是IL-6炎癥細(xì)胞內(nèi)的信

3、號分子，研究發(fā)現(xiàn)，CD患者腸粘膜LPMC表達(dá)STAT3增高，并有大量STAT3激活，激活的STAT3可能參與了T細(xì)胞抵抗AICD的機(jī)制。然而有學(xué)者認(rèn)為，STAT3分子在有的免疫細(xì)胞內(nèi)存在一定的抗炎作用。例如，單核細(xì)胞內(nèi)STAT3基因敲除的小鼠呈現(xiàn)對IL-10低反應(yīng)性，說明單核細(xì)胞內(nèi)STAT3能被IL-10激活。因此，STAT3蛋白在CD發(fā)病中的作用需要進(jìn)一步研究。 本實(shí)驗(yàn)中，我們在與CD免疫反應(yīng)類型及病理組織學(xué)十分類似的小鼠TN

4、BS結(jié)腸炎早期，用STAT3反義寡核苷酸(ASON)灌腸，以抑制STAT3的表達(dá)和激活，研究STAT3參與該結(jié)腸炎發(fā)病可能的機(jī)制，及抑制STAT3表達(dá)是否對結(jié)腸炎具有治療作用。 實(shí)驗(yàn)方法 在實(shí)驗(yàn)第1天，用0.1ml含2.0mgTNBS的50％乙醇溶液灌腸，用體重約22g的BALB/c小鼠造TNBS結(jié)腸炎模型，對照組小鼠僅用0.1ml50％乙醇灌腸。實(shí)驗(yàn)第3天，用15nmolSTAT3ASON或錯配反義寡核苷酸(MMAS)

5、灌腸治療。每天記錄小鼠體重。 實(shí)驗(yàn)第7天處死小鼠，分離炎癥最明顯處的結(jié)腸組織，用4％甲醛固定，HE染色，顯微鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)。 自新鮮的結(jié)腸組織中分離出LPMC，經(jīng)annexinV和PI染色后，流式細(xì)胞儀檢測LPMC的細(xì)胞凋亡，用存活的LPMC百分比來反映LPMC的凋亡情況。提取LPMC細(xì)胞總蛋白，Westernblot檢測STAT3、磷酸化STAT3(pSTAT3)、及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax等。

6、分別用免疫熒光、Westernblot等方法檢測每組小鼠結(jié)腸炎癥組織STAT3、pSTAT3的表達(dá)。用PBS對結(jié)腸組織進(jìn)行勻漿，分別檢測TNF-α、INF-γ的濃度和組織MPO活性。 結(jié)論 LPMC內(nèi)STAT3的激活參與了TNBS結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制：調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)LPMC對AICD抵抗。用STAT3ASON灌腸早期治療TNBS結(jié)腸炎，能減少炎癥細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)激活的LPMC凋亡。抑制LPMC的STAT3信