富氫培養(yǎng)液對(duì)脂多糖所致離體人腸上皮屏障功能障礙的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：膿毒癥是由感染因素誘發(fā)并且以炎性反應(yīng)為主的綜合征，是燒傷、創(chuàng)傷和大手術(shù)等的常見并發(fā)癥。腸上皮屏障能夠阻擋微生物、毒素等透過腸壁進(jìn)入人體內(nèi)其他組織、器官以及血液循環(huán)。腸屏障功能障礙是膿毒癥引發(fā)多器官功能障礙綜合征（MODS）的重要因素。緊密連接蛋白 occludin與黏附連接蛋白E-cadherin是腸上皮屏障的主要組成成分。內(nèi)毒素脂多糖（LPS）通過改變緊密連接蛋白和黏附連接蛋白的正常表達(dá)，造成腸上皮屏障通透性增加，引發(fā)腸屏障功能

2、障礙。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)氫氣對(duì)多種膿毒癥動(dòng)物模型具有明確的保護(hù)作用，但是其具體機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)研究擬運(yùn)用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系建立離體人腸屏障功能障礙模型，觀察富氫培養(yǎng)液在調(diào)節(jié) LPS誘發(fā)的腸屏障功能障礙中的作用，并深入探討其相關(guān)的作用機(jī)制。
　　方法：人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco2復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)至第28-35代之間時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。
　　第一部分：建立Caco2細(xì)胞單層模型。首先分別采用不同濃度的LPS（1，10，100μg/ml和1

3、mg/ml）孵育，于不同時(shí)間點(diǎn)（0，3，6，12，24，48 h）檢測(cè)跨上皮電阻（TER）值和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖的滲透系數(shù)（PE）。采用CCK-8法測(cè)定100μg/ml和1 mg/ml的LPS對(duì)Caco2細(xì)胞增殖活力的影響。隨機(jī)將細(xì)胞進(jìn)行分組（4組）：對(duì)照（control）組、富氫培養(yǎng)液（H2）組、脂多糖（LPS）組和LPS+H2組。按分組處理，于孵24 h時(shí)，分別檢測(cè)TER值和PE。分別于孵育6、12和24 h時(shí)，采用West

4、ern blot法測(cè)定occludin與E-cadherin的表達(dá)水平；于孵育24 h時(shí)，采用免疫熒光法測(cè)定occludin與E-cadherin的分布情況。
　　第二部分：首先按照第一部分的分組方法于孵育24h時(shí)，采用GST-Pulldown法測(cè)定Caco2細(xì)胞中Ras同源家族蛋白A（RhoA）的活性。細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分組（5組）：control組、LPS組、LPS+H2組、LPS+H2+RhoA激動(dòng)劑CN03（LPS+H2+CN0

5、3）組、LPS+RhoA抑制劑C3胞外酶（LPS+C3）組。Control組、LPS組以及LPS+H2組處理同第一部分。LPS+H2+CN03組中，于孵育前3 h時(shí)加入1μg/ml的CN03。LPS+ C3組中，于孵育前1 h時(shí)加入2.5μg/ml的C3胞外酶。于孵育24 h時(shí)測(cè)定腸屏障模型的TER值與PE。分別采用Western blot法和免疫熒光法測(cè)定occludin與E-cadherin的表達(dá)與分布情況。
　　第三部分：首

6、先按照第一部分的分組方法于孵育24h時(shí)，Western blot法測(cè)定哺乳動(dòng)物Diaphanous相關(guān)成蛋白1（mDia1）的表達(dá)水平。慢病毒法轉(zhuǎn)染Caco2細(xì)胞，對(duì)mDia1進(jìn)行RNA干擾，并獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。將細(xì)胞隨機(jī)分為5組：control組、LPS組、RNA干擾（siRNA mDia1）組、LPS+H2組和siRNA mDia1+LPS+H2組。其中，control組、LPS組和LPS+H2組處理同前；siRNA mDia1組

7、和siRNA mDia1+LPS+H2組使用穩(wěn)定表達(dá)mDia1干擾片段的Caco2細(xì)胞。于孵育24 h時(shí)測(cè)定腸屏障模型的TER值與PE。分別采用Western blot法和免疫熒光法測(cè)定occludin與E-cadherin的表達(dá)與分布情況。
　　結(jié)果：第一部分：與0μg/ml LPS組比較，100μg/ml和1 mg/ml的LPS孵育6-48 h的時(shí)間范圍內(nèi)，TER值下降且PE均降低升高，趨勢(shì)呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性，并且在24 h時(shí)變

8、化程度最為明顯；100μg/ml LPS對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響，而1mg/ml LPS組中細(xì)胞活力顯著降低。Control組與H2組比較，上述各指標(biāo)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與control組比較，在LPS組孵育24 h時(shí)腸屏障模型的TER值降低， PE升高；孵育6-24 h時(shí)，occludin和E-cadherin的表達(dá)均下調(diào)；孵育24 h時(shí)， occludin和E-cadherin在細(xì)胞膜處分布減少，在細(xì)胞質(zhì)中分布增多，“鐵絲網(wǎng)”樣形態(tài)的

9、連續(xù)性與完整性破壞。與LPS組比較，LPS+H2組孵育24 h時(shí)腸屏障模型的TER值升高，PE降低；孵育6-24 h時(shí)，occludin和E-cadherin的表達(dá)均上調(diào)；孵育24 h時(shí)，occludin和E-cadherin在細(xì)胞膜處分布增多，在細(xì)胞質(zhì)中分布減少，“鐵絲網(wǎng)”樣形態(tài)的連續(xù)性與完整性改善。
　　第二部分：與control組比較，LPS組中RhoA活性升高；與LPS組比較， LPS+H2組中RhoA活性降低。與LPS+

10、H2組比較，LPS+H2+CN03組中TER值降低且PE升高，occludin和E-cadherin表達(dá)下調(diào)，且分布紊亂。與LPS組比較，LPS+C3組中，TER值升高且PE降低，occludin和E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，分布情況改善。
　　第三部分：與control組比較，LPS組mDia1表達(dá)降低，LPS+H2組mDia1表達(dá)升高。與control組比較，siRNA mDia1組TER值降低且PE升高，occludin