β-arrestin2對小鼠腸炎及腸上皮屏障功能的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性腸道炎性疾病，是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的主要臨床類型之一。臨床上以反復(fù)腹痛、腹瀉和黏液血便為主要癥狀，病情反復(fù)，病程漫長，存在一定的癌變風(fēng)險，目前病因和發(fā)病機制尚未完全明確。
　　β-arrestins包括β-arrestin1和β-arrestin2兩種類型，是G蛋白偶聯(lián)受體（G-pr

2、otein coupled receptors，GPCRs）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要負性調(diào)節(jié)因子，同時還作為接頭蛋白參與許多非GPCR信號通路，調(diào)控細胞的增殖、生存、凋亡以及基因轉(zhuǎn)錄等多個過程，在炎癥免疫相關(guān)通路中也發(fā)揮著重要作用，參與包括IBD在內(nèi)的多種免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展。
　　有研究發(fā)現(xiàn)，人類腸道炎癥伴隨著腸粘膜屏障功能的損害，炎癥早期即出現(xiàn)腸道滲透性的增加。同時，人類全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide associat

3、ion study，GWAS)提示UC易感基因中包括腸粘膜屏障相關(guān)基因，動物研究也發(fā)現(xiàn)炎癥條件下腸上皮細胞凋亡增加而增殖受抑制，可見腸粘膜屏障功能障礙是IBD的重要發(fā)病機制之一。腸上皮屏障是腸粘膜屏障的重要組成部分，由完整的腸上皮層細胞以及細胞連接組成。其中，緊密連接是腸上皮層細胞連接的主要方式，被認為是腸上皮屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。緊密連接包括至少50種膜相關(guān)蛋白，目前研究發(fā)現(xiàn)，其中具有關(guān)鍵作用的蛋白包括閉鎖蛋白(occludin)、水閘蛋白

4、(claudins)和閉鎖小帶(zona occludens，ZOs)。Claudins和occludin均為跨膜蛋白，二者相互連接共同構(gòu)成緊密連接的主要結(jié)構(gòu)，ZOs作為緊密連接中的支架蛋白能夠與claudins和occludin連接，并且與細胞骨架纖維蛋白產(chǎn)生廣泛聯(lián)系，從而構(gòu)成穩(wěn)定的緊密連接復(fù)合體。炎癥條件下，緊密連接蛋白的表達和分布發(fā)生改變，可能導(dǎo)致腸粘膜屏障的破壞，腸道通透性明顯增加，細菌和毒素發(fā)生易位，腸粘膜免疫反應(yīng)過度或失調(diào)，

5、最終導(dǎo)致腸道慢性炎癥的發(fā)生。
　　目前β-arrestins對IBD的機制研究主要集中在免疫、炎癥反應(yīng)和腸上皮細胞的凋亡和增殖，而β-arrestins對腸上皮滲透性及腸上皮層細胞連接影響的研究較少。同時β-arrestin2是對腸炎起抑制作用還是促進作用仍存在爭議。已知DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型是研究UC的較理想和普遍使用的模型，本研究首先檢測β-arrestin2在腸炎時結(jié)腸組織中的表達變化，隨后利用β-arrestin2-/-

6、小鼠研究該基因?qū)δc炎的影響，最后初步探討β-arrestin2在腸炎時對腸上皮滲透性和緊密連接的影響，從而了解β-arrestin2對腸上皮屏障功能的作用。
　　方法：
　　用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）制備小鼠急性腸炎模型，將實驗對象分為三組：野生型對照(WT)組、野生型腸炎(WT+DSS)組和β-arrestin2-/-腸炎(KO+DSS)組。比較β-arrestin2在WT組和W

7、T+DSS組結(jié)腸組織中mRNA和蛋白表達水平;比較WT+DSS組和KO+DSS組的體重下降程度、疾病活動指數(shù)、脾臟重量、結(jié)腸長度及HE染色病理學(xué)表現(xiàn)和評分、腸上皮FITC-D滲透率及緊密連接關(guān)鍵蛋白（occludin，claudin1和ZO-1）的蛋白表達水平。
　　計量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤（(x)±S(x)）表示，利用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗分析，三組間比較采用one-way ANOV

8、A，P＜0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.β-arrestin2在腸炎小鼠結(jié)腸組織中表達升高
　　相比于WT組，WT+DSS組小鼠結(jié)腸組織中β-arrestin2mRNA水平上調(diào)（1.006±0.066VS2.103±0.438，P=0.048），蛋白表達水平也明顯升高。
　　2.β-a rrestin2基因敲除有利于抑制小鼠腸炎進展
　　相比于WT+DSS組，KO+DSS組小鼠體重下降較緩

9、，第5、6和7天均存在統(tǒng)計學(xué)差異（98.262±0.870VS94.524±1.253，P=0.045;94.167±0.766VS89.458±1.462，P=0.029;89.523±2.301VS81.094±1.402，P=0.020）;疾病活動指數(shù)上升較緩，第5、6和7天均存在統(tǒng)計學(xué)差異（1.585±0.210VS2.468±0.200，P=0.019;2.168±0.397VS3.202±0.200,P=0.042;2.91

10、8±0.158VS3.934±0.066,P＜0.001)，脾臟腫大程度更輕（74.950±2.430VS127.180±9.801，P=0.002），結(jié)腸縮短程度較?。?.425±0.217VS5.320±0.227，P=0.011），腸粘膜腺體保留較完整，炎癥細胞浸潤較少，病理學(xué)評分較低（2.333±0.211VS3.667±0.211，P=0.002）。
　　3.β-a rrestin2基因敲除有利于維持腸上皮滲透性和緊密連