MBL在內毒素刺激條件下對腸粘膜屏障功能的保護作用及機制研究.pdf

1、背景與目的:
　　腸上皮細胞是排列于腸道的單層上皮細胞，隔絕外界環(huán)境影響，保護機體內穩(wěn)態(tài)的重要器官。它的功能主要包括營養(yǎng)物質的吸收和防御外界侵襲的防御功能。腸道的吸收功能維持身體所必須的營養(yǎng)物質包括糖，脂肪，蛋白質，氨基酸，維生素和微量元素等。腸道的防御功能是以屏障的防御功能為主，主要由四個部分構成即化學屏障、生物屏障、免疫屏障和機械屏障[1-4]。其中機械和免疫屏障之間存在相互調控進而增強了屏障的防御功能，維持腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的核

2、心。炎癥性腸病(IBD)、全胃腸外營養(yǎng)(TPN)、內毒素、燒傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷和手術應激等病理條件下均可導致腸屏障功能障礙，破壞屏障的完整性，增加腸道通透性，引發(fā)腸源性感染，導致原發(fā)疾病加重，最終誘發(fā)機體損傷，導致多器官功能衰竭[4]。
　　固有免疫系統(tǒng)在一線防御中起到重要作用[5]，其主要包括上皮屏障（皮膚，粘膜上皮），可溶性分子（抗菌肽，補體，細胞因子和天然抗體），吞噬細胞（巨噬細胞和中性粒細胞）和膜式識別受體（TLRs、NLRs、清

3、道夫受體和C型凝集素受體）。甘露糖結合凝集素(Mannose binding lectin，MBL)作為固有免疫的重要成分。其屬于凝集素超家族成員之一。其功能結構域主要由糖基識別位點和膠原樣位點構成。其中糖基位點(carbohydrate recognition domain，CRD)可以識別微生物并，再通過膠原樣位點(collagen like domain，CLD)與MBL相關蛋白酶(MBL-associated serine pr

4、oteases，MASPs)形成復合物進而激活下游的補體途徑。此外，MBL還可以識別細胞上的受體并與吞噬細胞結合，發(fā)揮吞噬清除功能。
　　在過去十年的研究中顯示MBL與腸粘膜屏障密切相關，如在急性IBD模型中，MBL基因缺陷小鼠的腸道粘膜損傷較重，并且死亡率較高，而補體C3基因缺陷小鼠的腸道損傷較輕。同時在細菌侵入腸道研究中，發(fā)現MBL可以與細菌直接結合并清除，減少炎癥因子的釋放，從而保護腸粘膜屏障[5，6]。
　　上述研究

5、主要圍繞MBL的補體激活功能，而MBL的非補體功能研究較少，因此本實驗主要探討MBL的非補體依賴功能。本課題擬在體內體外模型中，應用免疫印記、real-timePCR、免疫熒光、跨上皮電阻測定等技術，探討內毒素條件下MBL通過何種方式參與調控腸屏障功能，并探討其中作用機制，為MBL缺陷患者腸道保護提供新思路。
　　方法:
　　1.建立小鼠內毒素血癥模型，應用免疫熒光、HE染色、Ussing Chamer技術，觀察腸粘膜損傷情

6、況。
　　2.圍繞內毒素模型，應用免疫組化，熒光定量PCR，免疫印跡法等技術，觀察內毒素刺激后MBL表達情況。
　　3.通過構建MBL干擾質粒，應用免疫印跡法，熒光定量PCR，免疫熒光，TER等技術，觀察腸上皮屏障功能的變化情況。
　　4.體外Caco-2細胞上用MBL刺激后，檢測上皮細胞損傷以及屏障功能變化情況，明確MBL對屏障的影響。
　　結果:
　　1.LPS處理后，腸粘膜正常形態(tài)學改變，絨毛斷裂、水

7、腫，上皮細胞脫落，粘膜通透性增加，腸粘膜細胞凋亡增加。
　　2.LPS處理后，體內和體外MBL增多，通過免疫組化發(fā)現MBL定位在腸上皮細胞內。
　　3.體外干擾MBL后，觀察上皮細胞間的緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin較正常組降低，細胞間緊密連接結構受損，完整性差，連接中斷。并且通透性實驗(TER)顯示腸通透性增加。低濃度重組MBL處理Caco-2細胞后，上皮細胞凋亡增加不明顯，TJ蛋白表達升高，屏障通透性降

8、低，而高濃度的重組MBL組凋亡明顯增加
　　結論：
　　1.LPS處理腸上皮細胞后，屏障通透性增加，結構受到破壞，凋亡增加，上皮表達MBL增多。同樣在體外LPS處理腸上皮細胞后MBL表達也增多，提示MBL的表達可能在調節(jié)腸屏障功能中起到重要作用。
　　2.體外干擾MBL基因后，緊密連接蛋白表達減少，蛋白結構改變，腸粘膜通透性增加，表明MBL可能是參與緊密連接蛋白形成的調控進而調節(jié)腸粘膜屏障功能。而低濃度的重組MBL蛋白