TRPV4對結(jié)腸上皮屏障功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型過程中的Claudin蛋白磷酸化狀態(tài)的變化
　　背景：
　　潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是以免疫反應(yīng)和黏膜損傷為特征的腸道炎癥性疾病。有研究表明，腸屏障功能損傷是UC發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素，可導(dǎo)致細(xì)胞間隙通透性增加，細(xì)菌、內(nèi)毒素及大分子物質(zhì)容易穿過粘膜屏障誘導(dǎo)局部免疫功能紊亂，從而加重病理損傷。緊密連接蛋白的差異表達(dá)可導(dǎo)致緊密連接功能的障礙。最近研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中Clau

2、din-1、Claudin-3、Claudin-4、Claudin-5、Claudin-7和Claudin-8的表達(dá)下調(diào)。然而，這些研究都不足以證實(shí)Claudin表達(dá)的下調(diào)是導(dǎo)致UC產(chǎn)生的原因還是UC病變導(dǎo)致的結(jié)果。
　　最近有文獻(xiàn)報(bào)道，上皮細(xì)胞的屏障功能不僅與某些緊密連接蛋白的差異表達(dá)有關(guān)，其磷酸化修飾所導(dǎo)致的緊密連接蛋白變構(gòu)、胞吞和極性改變也是影響其功能的重要因素。其中，緊密連接蛋白某些基團(tuán)適度的磷酸化是維持其功能的必要條件，

3、但異常的磷酸化會改變它們之間的結(jié)合方式，影響聚集和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，導(dǎo)致跨上皮阻抗和上皮間隙通透性的改變，從而影響上皮屏障功能。國內(nèi)外研究也表明，腸粘膜屏障功能與某些緊密連接蛋白的磷酸化修飾改變有關(guān)。
　　脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是免疫細(xì)胞的激活劑，能夠?qū)е录毙苑螕p傷，同時伴隨著Claudin-4的表達(dá)下調(diào)。有文獻(xiàn)報(bào)道，在膽管上皮細(xì)胞單層中，LPS引起Claudin-1和Claudin-4的再分布。目前，很

4、少有文獻(xiàn)報(bào)道在結(jié)腸上皮細(xì)胞中LPS對Claudin磷酸化的影響。
　　在本研究中，我們探討了在葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium5000，DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸中Claudin磷酸化狀態(tài)的改變；同時評估了結(jié)腸形態(tài)學(xué)指標(biāo)、黏膜通透性和血清C-反應(yīng)蛋白(C-Reactive protein，CRP)的改變。此外，我們還檢測了LPS對T84細(xì)胞中Claudin及其磷酸化水平的影響。
　　目的：

5、　　1.探討在DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎中結(jié)腸Claudin的磷酸化狀態(tài)的改變。
　　2.探討LPS對結(jié)腸上皮細(xì)胞中Claudin磷酸化的影響。
　　方法：
　　1.制備結(jié)腸炎模型
　　實(shí)驗(yàn)采用健康雌性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對照組(6只)和DSS結(jié)腸炎模型組(18只)。正常組飲用蒸餾水7天作為對照，DSS結(jié)腸炎模型組自由飲用4%DSS水，于造模的第5、7、9天，分段收取大鼠的標(biāo)本，觀察相關(guān)指標(biāo)。
　　2.酶聯(lián)免

6、疫吸附測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)
　　利用ELISA法檢測實(shí)驗(yàn)大鼠血清中CRP水平。
　　3.免疫組織化學(xué)染色
　　利用免疫組化方法分別檢測磷酸化Claudin-3、磷酸化 Claudin-5、磷酸化Claudin-6、磷酸化Claudin-7在實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸上皮中的定位與表達(dá)。
　　4.蛋白免疫印跡
　　用Western Blotting檢測實(shí)驗(yàn)大

7、鼠結(jié)腸上皮中磷酸化Claudin的表達(dá)水平；在細(xì)胞水平，用Western Blotting檢測了LPS對T84細(xì)胞中Claudin磷酸化水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸損傷程度明顯高于正常對照組；且隨著DSS刺激時間的延長，損傷程度加重，黏膜通透性逐漸增加。
　　2.炎癥因子CRP隨著DSS刺激的延長而呈現(xiàn)出先高后低的規(guī)律。
　　3.磷酸化Claudin-3和磷酸化Claudin-

8、6免疫組化染色分布在結(jié)腸上皮隱窩的側(cè)面和腺管腔中。磷酸化Claudin-5免疫組化染色主要分布在腸上皮隱窩的頂端、側(cè)面和腺管腔。磷酸化Claudin-7分布在結(jié)腸上皮隱窩的頂端和腺管腔。
　　4.磷酸化Claudin-4和磷酸化Claudin-7的表達(dá)水平在DSS實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的第6天和第8天增加，磷酸化 Claudin-6的表達(dá)水平在第4天和第8天增加。磷酸化Claudin-5的表達(dá)水平在第4天減少，卻在第8天增加。
　　5

9、.與對照組相比，LPS干預(yù)T84細(xì)胞48 h后，磷酸化Claudin-3的表達(dá)水平明顯增加；72小時后，與對照組相比，磷酸化Claudin-3的表達(dá)水平明顯降低，磷酸化Claudin-6表達(dá)增加，磷酸化Claudin-5表達(dá)降低，與體內(nèi)研究結(jié)果相符。
　　結(jié)論：
　　1.DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型大鼠隨著病情進(jìn)展，結(jié)腸黏膜通透性逐漸增加，Claudin-4、Claudin-6、Claudin-7磷酸化水平升高，Claudin-5

10、磷酸化水平呈現(xiàn)先高后低的趨勢；
　　2.LPS干預(yù)結(jié)腸上皮細(xì)胞引起Claudin磷酸化水平升高，長時間干預(yù)可誘導(dǎo)Claudin磷酸化水平下降。
　　3.TRPV4對結(jié)腸上皮屏障功能的影響及其機(jī)制研究
　　背景：
　　潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是結(jié)腸慢性非特異性炎癥，臨床上主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的粘液膿血便和腹痛腹瀉，發(fā)病機(jī)制不明，病理損傷主要位于粘膜層與粘膜下層。結(jié)腸上皮的屏障功能障礙

11、是導(dǎo)致炎癥發(fā)生及加重的重要因素，其中，結(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接是維系腸道屏障功能的重要結(jié)構(gòu)，組成蛋白Claudin某些基團(tuán)的適度磷酸化是維持其功能的必要條件，異常的磷酸化會改變Claudin間的結(jié)合方式，影響緊密連接的聚集和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致跨上皮阻抗和上皮通透性的改變，最終影響上皮屏障功能。TRPV4是瞬時受體電位超家族(transient receptor potential vanilloid，TRPV)中重要成員之一,是非選擇性

12、通透鈣離子通道，常被認(rèn)為是細(xì)胞的感受器，易被多種刺激因素激活。TRPV4在胃腸道中表達(dá)廣泛，其功能改變可影響上皮屏障功能。因此，本研究觀察TRPV4在結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織中表達(dá)水平的改變，檢測TRPV4對Claudin磷酸化及細(xì)胞膜定位的影響，初步探討TRPV4對結(jié)腸上皮屏障功能的作用及機(jī)制。
　　目的：
　　1.觀察TRPV4在結(jié)腸炎模型結(jié)腸中的表達(dá)情況，檢測TRPV4在上皮細(xì)胞中的功能;
　　2.觀察TRPV4與Cl

13、audin的相互作用，TRPV4對Claudin-7磷酸化及細(xì)胞膜定位的影響，初步探討TRPV4通道對結(jié)腸上皮屏障功能的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1.結(jié)腸炎模型的制備
　　雌性小鼠，C57BL/6小鼠，隨機(jī)分四組：正常組自由飲用蒸餾水7天作為對照，DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型組自由飲用4%DSS水7天。藥物干預(yù)組，在自由飲用4%DSS水第3天，分別使用灌胃針灌服TRPV4激動劑(GSK1016790A，50 nmol/L

14、，1 ml/10 g)與TRPV4拮抗劑(HC067047，10μmol/L，1 ml/10 g)，每日一次，于造模的第8天，收取小鼠的標(biāo)本，觀察相關(guān)指標(biāo)。
　　2.免疫組織化學(xué)染色
　　利用免疫組化方法分別檢測TRPV4、Claudin-7、磷酸化Claudin-7在實(shí)驗(yàn)動物結(jié)腸上皮中定位與表達(dá)。
　　3.蛋白免疫印跡
　　用Western Blotting分別檢測TRPV4激動劑/拮抗劑作用于NCM460細(xì)胞

15、后Claudin-7磷酸化水平的變化以及實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中TRPV4表達(dá)水平的變化。
　　4.免疫共沉淀
　　使用TRPV4抗體共沉淀Claudin，檢測結(jié)腸上皮細(xì)胞中TRPV4與Claudin間相互作用。
　　5.穩(wěn)轉(zhuǎn)野生型Claudin-7質(zhì)粒
　　用野生型Claudin-7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCM460細(xì)胞，篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，使用共聚焦顯微鏡觀察并記錄TRPV4激動劑和拮抗劑預(yù)處理后對細(xì)胞膜上Claudin-7

16、表達(dá)定位的影響。
　　6.細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測量
　　分別使用TRPV4通道激動劑/拮抗劑干預(yù)NCM460細(xì)胞，利用鈣成像熒光顯微鏡系統(tǒng)檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。
　　7.利用FD4檢測結(jié)腸通透性
　　檢測實(shí)驗(yàn)動物血清中FD4含量，反映結(jié)腸上皮屏障功能的損傷程度。
　　8.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
　　使用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測TRPV4激動劑和拮抗劑作用后，結(jié)腸上皮細(xì)胞修復(fù)功能的變化。
　　結(jié)果：
　　1

17、.與對照相比，結(jié)腸炎模型組及TRPV4拮抗劑干預(yù)的結(jié)腸炎組小鼠結(jié)腸上皮組織中TRPV4表達(dá)水平降低，TRPV4激動劑干預(yù)組結(jié)腸中TRPV4表達(dá)水平較結(jié)腸炎模型組明顯升高。
　　2.結(jié)腸上皮細(xì)胞中TRPV4和Claudin-4、Claudin-5、Claudin-7、Claudin-8存在相互作用。
　　3.激動TRPV4通道降低結(jié)腸上皮細(xì)胞Claudin-7磷酸化水平，拮抗TRPV4通道可增強(qiáng)結(jié)腸上皮細(xì)胞Claudin-7磷

18、酸化水平。
　　4.激動TRPV4可促使Claudin-7在細(xì)胞膜上的聚集，拮抗TRPV4預(yù)處理可減少Claudin-7在細(xì)胞膜上的聚集。
　　5.激動TRPV4明顯增加NCM460細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，拮抗劑預(yù)處理NCM460細(xì)胞可明顯減弱激動劑的作用。
　　6.與對照相比，結(jié)腸炎模型組及TRPV4拮抗劑干預(yù)的結(jié)腸炎組小鼠黏膜通透性明顯升高，TRPV4激動劑干預(yù)可明顯降低結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸上皮通透性，TRPV4激動劑可延緩結(jié)腸