下丘腦視前內(nèi)側(cè)核(MPO)TRPV4對(duì)急性冷暴露過(guò)程中大鼠BAT產(chǎn)熱的影響.pdf

1、瞬時(shí)感受器電位(transientreceptorpotential,TRP)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的主要與感受功能有關(guān)的膜通道蛋白家族,主要包括TRPC、TRPV、TRPM等。TRPV4(又稱VR-OAC、VRL2或OTRPC4)是TRPV家族成員之一。TRPV4是瞬時(shí)感受器電位的野香草受體亞家族(TRPV)的成員之一。在離體建立的細(xì)胞表達(dá)系證明,TRPV4通道具有溫控特性,可被27℃以上的溫?zé)岽碳ぜせ?并可產(chǎn)生一個(gè)較強(qiáng)的鈣離子內(nèi)流。
　

2、　 褐色脂肪組織(brownadiposetissue,BAT),是哺乳動(dòng)物體內(nèi)非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱的主要來(lái)源。BAT的主要功能是通過(guò)非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱維持動(dòng)物的體溫及能量平衡。
　　 下丘腦視前內(nèi)側(cè)核(medialpreopticnucleus,MPO)對(duì)支配BAT的交感神經(jīng)節(jié)前神經(jīng)元的活性存在緊張性抑制作用,進(jìn)而調(diào)控BAT產(chǎn)熱活動(dòng)。但其作用的生物學(xué)機(jī)制還不清楚。在下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞MPO存在有TRPV4,該通道具有溫度感受特性,我們推測(cè)

3、TRPV4可能通過(guò)影響MPO神經(jīng)元活動(dòng),繼而影響B(tài)AT產(chǎn)熱活動(dòng),參與體溫調(diào)節(jié)過(guò)程。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在探討下丘腦視前內(nèi)側(cè)核的TRPV4參與體溫調(diào)節(jié)的中樞機(jī)制。應(yīng)用冷暴露制作大鼠BAT產(chǎn)熱增加的模型,結(jié)合在MPO給予TRPV4特異性激動(dòng)劑4αPDD或特異性阻斷劑RN1734,觀察其對(duì)體溫BAT產(chǎn)熱活動(dòng)的影響。
　　 方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理
　　 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
　　 選用健康雄性SD大

4、鼠,體重220～250g,基礎(chǔ)體溫(38.1±0.2)℃,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將動(dòng)物隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組(N)、單純冷暴露組(C)、4αPDD組(P)、4αPDD+冷暴露組(P+C)、RN1734組(R)、RN1734+冷暴露組(R+C)。
　　 (2)大鼠MPO插管和體溫測(cè)量發(fā)射子植入
　　 下丘腦MPO插管:將大鼠用10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉,然后將其頭部固定于立體定位儀上,暴露前囟。參照

5、大鼠腦圖譜,向下丘腦MPO(B:0mm;L/R:1.5mm;V:8.3mm)與矢狀面成10°夾角,兩側(cè)分別插入一不銹鋼管,并留置與之相匹配的針芯,用牙托水加牙科水泥固定。
　　 檢測(cè)插管位置:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,在MPO中微量注射液體染料亞甲藍(lán)1ul。隨后用4％多聚甲醛經(jīng)大鼠心臟灌流,取出經(jīng)多聚甲醛固定的大腦。將其置于30％蔗糖溶液中脫水后,制備冰凍切片,顯微鏡下觀察插管位置。
　　 體溫遙測(cè)發(fā)射子植入:在麻醉狀態(tài)下,于大鼠腹腔

6、植入遙測(cè)系統(tǒng)發(fā)射子。術(shù)后動(dòng)物單籠飼養(yǎng),恢復(fù)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 2、體溫測(cè)量
　　 應(yīng)用BW-200生理無(wú)線遙測(cè)系統(tǒng)測(cè)量大鼠體溫。實(shí)驗(yàn)前一日早上8時(shí)開(kāi)始記錄大鼠基礎(chǔ)體溫,每隔30分鐘測(cè)量體溫1次,共測(cè)量6小時(shí),取其平均值記為基礎(chǔ)體溫。實(shí)驗(yàn)均在早8時(shí)開(kāi)始,各組在相應(yīng)處理后開(kāi)始監(jiān)測(cè)體溫變化,每隔5分鐘自動(dòng)記錄體溫一次,直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
　　 3、下丘腦MPO細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)測(cè)定
　　 采用日

7、立F-4500型熒光雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)測(cè)定。
　　 4、下丘腦MPO中TRPV4表達(dá)測(cè)定
　　 (1)Westernblot檢測(cè)下丘腦MPO中TRPV4表達(dá)。對(duì)照選用抗β-肌動(dòng)蛋白抗體(β-actin)。目的蛋白與相應(yīng)β-actin蛋白的灰度比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　 (2)免疫熒光檢測(cè)下丘腦MPO中TRPV4表達(dá),熒光顯微鏡下觀察并攝片。
　　 5、BAT組織中UCP1mRNA表達(dá)測(cè)定

8、　　 采用RT-PCR方法,擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為478bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳后,用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行基因表達(dá)水平分析。
　　 6、大鼠BAT質(zhì)量及BAT總蛋白含量測(cè)定
　　 用Folin-酚法,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn),采用分光光度計(jì)測(cè)定BAT樣品中的總蛋白質(zhì)的濃度。
　　 7、BAT中線粒體蛋白含量檢測(cè)
　　 提取BAT中線粒體,線粒體蛋白質(zhì)定量用Folin-酚法,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn),采用分光

9、光度計(jì)測(cè)定。
　　 8、大鼠BAT中細(xì)胞色素C氧化酶(COX)活性檢測(cè)
　　 使用COX活性檢測(cè)試劑盒(GENMED,USA)檢測(cè)COX活性。
　　 9、數(shù)據(jù)分析
　　 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,各組均數(shù)間差異的比較應(yīng)用t檢驗(yàn),相關(guān)分析用相關(guān)性檢驗(yàn)分析法。
　　 結(jié)果：
　　 與對(duì)照組(N)比較,單純給予TRPV4特異性激動(dòng)劑4αPDD組(P),體溫?zé)o明顯變化;BAT

10、質(zhì)量、BAT總蛋白含量和線粒體蛋白含量、UCP-1mRNA表達(dá)量、細(xì)胞色素C氧化酶活性均無(wú)明顯變化;MPO中TRPV4表達(dá)增加,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。單純給予TRPV4特異性阻斷劑RN1734組(R),體溫明顯升高;BAT質(zhì)量、BAT總蛋白含量和線粒體蛋白含量明顯降低,UCP-1mRNA表達(dá)量、細(xì)胞色素C氧化酶活性明顯升高;MPO中TRPV4表達(dá)降低,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低。
　　 與對(duì)照組(N)比較,單純冷暴露組(C)的體溫下降

11、,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;BAT質(zhì)量減少、BAT總蛋白含量和線粒體蛋白含量減少、UCP-1mRNA表達(dá)量增加、細(xì)胞色素C氧化酶活性增加;MPO中TRPV4表達(dá)略增加,但細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低。
　　 與單純冷暴露組(C)比較,預(yù)先給予4αPDD后進(jìn)行冷暴露組(P+C),冷暴露時(shí)體溫明顯下降;BAT質(zhì)量、BAT總蛋白含量和線粒體蛋白含量減少的幅度低于C組;MPO中TRPV4蛋白表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度高于C組。預(yù)先給予RN1734+冷暴露組(

12、R+C),冷暴露時(shí)體溫明顯高于C組;BAT質(zhì)量、BAT總蛋白含量和線粒體蛋白含量減少的幅度高于C組;MPO中TRPV4蛋白表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均低于C組。
　　 結(jié)論：
　　 1、FRPV4特異性激動(dòng)劑4αPDD或特異性阻斷劑RN1734,能分別誘導(dǎo)或抑制通道在細(xì)胞膜上的表達(dá)。
　　 2、在下丘腦MPO區(qū)給予4αPDD或RN1734,分別能增加或減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。
　　 3、在下丘腦MPO區(qū)給予4α