下丘腦背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)肽Y表達(dá)缺失對(duì)大鼠脂肪組織脂代謝的影響研究.pdf

1、背景：肥胖及肥胖相關(guān)性疾病嚴(yán)重威脅著人類健康，已成為全世界亟待解決的課題。人類和哺乳動(dòng)物體內(nèi)，白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）主要司儲(chǔ)存能量，棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）增強(qiáng)非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱、增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗。成年嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)肩胛間區(qū)存在棕色脂肪組織，而腹股溝區(qū)、附睪、內(nèi)臟脂肪組織則為白色脂肪組織。在一定干預(yù)條件下，白色脂肪組織可以發(fā)生棕色樣改變。PR結(jié)構(gòu)

2、域家族的第16個(gè)成員PRDM16（PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain containing16）是BAT中高表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在棕色脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中起正向調(diào)節(jié)作用，參與誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體數(shù)量增多和功能增強(qiáng)，增強(qiáng)線粒體氧化磷酸化，加速能量消耗和熱量生成。Ⅱ型脫碘酶（TypeⅡiodothyronine deiodinase，Dio-2）是棕色脂肪組織的分子標(biāo)志之一，在棕色脂肪細(xì)胞可通過(guò)與解偶聯(lián)蛋白1（unc

3、oupling protein1，UCP1)的基因特異位點(diǎn)結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)能量代謝。下丘腦在維持能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）是一種重要的促食欲肽，對(duì)攝食的調(diào)節(jié)多依賴于下丘腦中的NPY神經(jīng)元，在下丘腦，NPY存在于弓狀核、背內(nèi)側(cè)核等區(qū)域，以弓狀核含量最豐富。研究顯示，特異性敲除高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠下丘腦弓狀核NPY基因可改善肥胖大鼠的能量代謝。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21（fibroblast

4、growth factor-21，F(xiàn)GF21）可表達(dá)于肝臟、脂肪組織和胰腺等器官和組織（嚙齒類動(dòng)物），通過(guò)形成 FGF21/?-Klotho/FGFR復(fù)合體發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，改善糖脂代謝。FGF21經(jīng)交感神經(jīng)系統(tǒng)誘導(dǎo)WAT中出現(xiàn)米色或棕色脂肪細(xì)胞。而下丘腦背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)肽 Y表達(dá)缺失與脂肪組織內(nèi)脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平（如 PRDM16、Dio-2、FGF21）的關(guān)系，尚未見明確報(bào)道。
　　目的：建立下丘腦背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)肽Y表達(dá)缺失

5、的大鼠動(dòng)物模型，并給予高脂飲食干預(yù)，探討大鼠的體重改變和脂肪組織脂代謝相關(guān)基因PRDM16、Dio-2和FGF21表達(dá)變化。
　　方法：建立動(dòng)物模型：4-5周齡雄性清潔級(jí)SD大鼠80只，其中體重為270-300g的大鼠20只，體重為130-150g的大鼠60只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，構(gòu)建腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）介導(dǎo)的帶有熒光標(biāo)記的RNAi（RNA interference）重組轉(zhuǎn)運(yùn)體（AAVs

6、hNPY及 AAVshCTL），病毒滴度為1×109 particles/site。其中AAVshNPY導(dǎo)致表達(dá)缺失，AAVshCTL是作為對(duì)照的空載體。用270-300g的大鼠驗(yàn)證建模是否成功，根據(jù)Paxinos和Watson大鼠腦圖譜定位DMH的位置。隨機(jī)選取15只分別接受雙側(cè)DMH的AAVshNPY注射，并在注射病毒的1、2和4周后（每周隨機(jī)選取5只）處死，再隨機(jī)選取5只分別接受雙側(cè)DMH的AAVshCTL注射，注射4周后處死。處

7、死后迅速取下丘腦，一部分置于液氮中保存，制作冰凍切片觀察轉(zhuǎn)染位置，一部分制作石蠟切片應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)DMH NPY mRNA的表達(dá)，確定病毒重組體能夠敲除DMH NPY即建模成功；將余60只大鼠隨機(jī)均分為兩組，根據(jù)Paxinos和Watson大鼠腦圖譜定位 DMH的位置。上述兩組分別接受雙側(cè) DMH的AAVshNPY（AAVshNPY組）及AAVshCTL空載體（AAVshCTL組）注射，完成動(dòng)物模型的建立。每周1次于固定時(shí)間對(duì)

8、各組大鼠進(jìn)行稱重并記錄。實(shí)驗(yàn)1～4周所有大鼠給予常規(guī)飲食（regular chow，RC），第5周再?gòu)腁AVshNPY組及AAVshCTL組各自隨機(jī)選取一半大鼠給予高脂飲食（high fat diet，HF），其余大鼠仍給予常規(guī)飲食，此時(shí)所有大鼠被分為AAVshNPY HF組、AAVshNPYRC組、AAVshCTL HF組、AAVshCTL RC組。注射病毒16周后處死大鼠，采集腹股溝區(qū)和附睪脂肪組織，液氮保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（R

9、eal time PCR）法測(cè)定大鼠腹股溝區(qū)和附睪脂肪組織FGF21mRNA、PRDM16mRNA、Dio-2 mRNA的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）測(cè)定大鼠腹股溝區(qū)和附睪脂肪組織中PRDM16蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：⑴攜帶紅色熒光的病毒成功注入下丘腦背內(nèi)側(cè)核，注射后，AAVshNPY組的NPY mRNA表達(dá)水平低于AAVshCTL組，分別將注射1、2、4周后AAVshNPY組與AAVshCTL組比較，均

10、有顯著差異（P?0.05）。⑵第5周添加高脂飲食前AAVshNPY組與AAVshCTL組比較，有顯著差異（P?0.05），提示DMH NPY缺失已開始導(dǎo)致體重增速減緩；第16周末：與常規(guī)飲食組大鼠相比，高脂飲食組大鼠體重增加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?0.01），提示高脂飲食誘導(dǎo)大鼠體重增長(zhǎng)迅速；與AAVshCTL組相比，AAVshNPY組體重增長(zhǎng)量明顯較低，有顯著差異（P?0.01），提示DMH NPY缺失可引起體重增長(zhǎng)緩慢。⑶腹股溝

11、區(qū)和附睪脂肪組織FGF21mRNA的表達(dá)均呈現(xiàn)以下特征：AAVshCTL組與AAVshNPY組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），提示DMH NPY敲除對(duì)脂肪組織FGF21表達(dá)無(wú)影響；與RC組相比，HF組大鼠均呈現(xiàn)低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），提示高脂飲食降低脂肪組織FGF21的表達(dá)。各組大鼠附睪脂肪組織中PRDM16和Dio-2 mRNA的表達(dá)水平均較低，兩者的組間兩兩比較提示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。提示DMH N

12、PY表達(dá)缺失和高脂飲食對(duì)附睪脂肪組織PRDM16、Dio-2 mRNA的表達(dá)均無(wú)影響。腹股溝區(qū)脂肪組織PRDM16和Dio-2 mRNA的表達(dá)一致，如下：與AAVshCTL相比，AAVshNPY組的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），提示DMH NPY敲除引起PRDM16和Dio-2 mRNA高表達(dá)；與RC組相比，HF組表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），提示高脂飲食誘導(dǎo)PRDM16和Dio-2 mRNA表達(dá)下降

13、。⑷與AAVshCTL高脂飲食組相比，AAVshNPY高脂飲食組腹股溝區(qū)脂肪組織PRDM16蛋白高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；與AAVshCTL常規(guī)飲食組相比，AAVshCTL高脂飲食組腹股溝區(qū)脂肪組織PRDM16蛋白低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。而附睪脂肪組織中，組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?0.05）。與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致。
　　結(jié)論：①下丘腦背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)肽Y表達(dá)缺失能上調(diào)大鼠腹股溝區(qū)脂肪組織棕色脂