尼古丁對大鼠下丘腦室旁核小細(xì)胞神經(jīng)元活動的影響.pdf

1、目的：下丘腦室旁核（PVN）小細(xì)胞神經(jīng)元調(diào)控自主神經(jīng)活動，在心血管功能、神經(jīng)內(nèi)分泌活動及能量代謝調(diào)節(jié)方面起重要作用。在體實驗研究表明，尼古丁可活化PVN神經(jīng)元煙堿樣受體，影響攝食、能量代謝和神經(jīng)內(nèi)分泌功能，然而在離體條件下，活化煙堿樣受體對PVN小細(xì)胞神經(jīng)元活動影響機制尚無報道。因此，本研究聯(lián)合應(yīng)用膜片鉗記錄、組織化學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)等技術(shù)手段，在新生大鼠下丘腦切片上觀察尼古丁對大鼠下丘腦小細(xì)胞神經(jīng)元自發(fā)性放電和興奮性突觸后電流（sEPSC

2、）活動的影響；研究尼古丁對自發(fā)性活動影響的劑量依存性以及半數(shù)有效濃度；探討 PVN內(nèi)尼古丁敏感小細(xì)胞神經(jīng)元的組織學(xué)特征；明確尼古丁對 PVN小細(xì)胞神經(jīng)元的影響機制，有助于闡明尼古丁對心血管及下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌功能活動的調(diào)節(jié)機理。
　　方法：出生后14-21d的Wistar雄性的大鼠。使用異氟烷深度麻醉后，斷頭取腦，使用萊卡1200S全自動振動切片機制備厚度為250μm、內(nèi)含PVN的下丘腦切片。在室溫下，將下丘腦切片置于充95％O2和

3、5%CO2混合氣體的人工腦脊液中孵育1h以上。人工腦脊液由以下成分構(gòu)成(in mM)：118 NaCl,3 KCl,1 MgCl2·6H2O,1 NaH2PO4·2H2O,25 NaHCO3,10 D-Glucose,2 CaCl2;PH:7.3-7.4,滲透壓為295-305 mOsM。記錄電極內(nèi)灌裝10μl內(nèi)液，電極阻抗為4-6 MΩ。聯(lián)合應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗、生物素染色和神經(jīng)藥理學(xué)手段研究尼古丁對PVN小細(xì)胞神經(jīng)元自發(fā)性放電頻率、膜電

4、位和sEPSCs的影響。PVN神經(jīng)元全細(xì)胞膜片鉗記錄是通過Axon-700B膜片鉗放大器、Digidata1400A系列數(shù)模轉(zhuǎn)換器、Clampex10.4數(shù)據(jù)包和電腦來實現(xiàn)的，數(shù)據(jù)采集后存于移動硬盤和DVD光盤用于分析，只有記錄完整且基線穩(wěn)定的實驗數(shù)據(jù)用于數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)束后腦片用4%多聚甲醛在室溫下固定24h后，然后置于生物素復(fù)合物中過夜。通過 DAB組織化學(xué)檢測生物素分布，顯微鏡下分析記錄細(xì)胞的組織學(xué)特征。采用Clamp

5、fit10.4軟件對電生理實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，均數(shù)的比較采用配對T檢驗，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：⑴PVN小細(xì)胞神經(jīng)元胞體平均直徑為12.6±1.10μm，樹突個數(shù)為2-6個；自發(fā)性放電頻率為2.21±0.24 Hz，平均膜電位為-54.7±1.3mV。⑵在電流鉗記錄模式下，灌流尼古丁(1μM)可使46.6%的PVN小細(xì)胞神經(jīng)元產(chǎn)生可逆性膜電位去極化和放電頻率增加。⑶尼古丁對部分P