蛙皮素對下丘腦和海馬神經(jīng)元的作用研究.pdf

1、目的：蛙皮素(Bombesin),是一種腦腸肽,由14個氨基酸殘基組成,對飲食和行為具有調(diào)節(jié)作用。在哺乳動物中,它的同類物有胃泌素釋放激素(gastrin-releasingpeptide,GRP)和神經(jīng)介素B(neuromedin B,NMB)。作為一種腦腸肽,蛙皮素對神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、缺血及學習記憶都具有良性作用。有研究表明在帕金森病人腦內(nèi)蛙皮素濃度增加,具有內(nèi)源性抗癲癇作用。此外還有很多實驗表明蛙皮素具有神經(jīng)保護作用。下丘腦弓形核(a

2、rcuate nucleus,ARC),是成年哺乳動物體內(nèi)能量平衡調(diào)節(jié)的重要區(qū)域。弓形核內(nèi)的神經(jīng)肽Y(neuropipte Y,NPY)神經(jīng)元具有增加飲食的作用。本文使用NPY-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠,研究蛙皮素對于下丘腦弓形核內(nèi)NPY神經(jīng)元的作用及其可能機制。另外,還探索了蛀皮素對于腦缺血引起的大鼠學習記憶障礙的作用及其對于大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元離子通道的作用,從而進一步提供了蛙皮素神經(jīng)保護作用的證據(jù)。
　　 方法：第一部分:選取N

3、PY-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠,NPY神經(jīng)元中綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)的表達由免疫組織化學和單細胞逆轉(zhuǎn)錄PCR(single-cellreverse transcription-PCR)確認。運用全細胞膜片鉗技術(shù),研究小鼠下丘腦腦片NPY神經(jīng)元的電生理特性。首先觀察蛙皮素對NPY神經(jīng)元興奮性的影響,然后觀察蛙皮素對于NPY神經(jīng)元串聯(lián)電阻,反轉(zhuǎn)電位的作用,最后在不同內(nèi)外液條件下觀察蛙皮素對NPY神經(jīng)

4、元的作用,來闡明蛙皮素對NPY神經(jīng)元的作用機制。除此之外,我們還使用了蛙皮素家族的肽類(NMB和GRP)以及其他與飲食有關(guān)的肽類,比較了不同肽類對NPY神經(jīng)元的作用。最后,還觀察了蛀皮素對阿黑皮原(proopiomelanocortin,POMC)神經(jīng)元的作用,與其對NPY神經(jīng)元的作用進行比較。第二部分:選取18只成年Wistar大鼠,隨機分成正常組、缺血組和缺血后蛙皮素干預組。用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎的方法制作大鼠全腦缺血模型,使用Morr

5、is水迷宮和長時程增強(long-term potentiation,LTP)記錄的方式來研究蛙皮素對缺血引起的學習記憶障礙的作用。然后使用幼年Wistar大鼠,制作海馬腦片,用膜片鉗中的電壓鉗技術(shù)研究蛙皮素對鈉離子通道的作用。所有實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Student f檢驗或ANOVA等統(tǒng)計學處理,P<0.05表示存在顯著性差異。
　　 結(jié)果：⑴從弓形核中收獲單個GFP陽性神經(jīng)元后,運用單細胞RT-PCR技術(shù)觀察GFP陽性神經(jīng)元中含有NP

6、Y編碼的mRNA,從而證明NPY-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠系建立成功。⑵蛙皮素(25011M)使NPY神經(jīng)元動作電位頻率增加了61.5±14.2％(n=15,P<0.05),使神經(jīng)元的膜電位去極化5.0±0.5 mV(n=15,P<0.05)。⑶NMB(250nM)使NPY神經(jīng)元動作電位頻率增加66.5±10.6％(n=16,P<0.05),使神經(jīng)元的膜電位去極化5.6±0.4 mV(n=16,P<0.05)。GRP(250nM)使NPY神經(jīng)元

7、動作電位頻率增加9.2±10.5％(n=13,P>0.05),使神經(jīng)元的膜電位去極化2.6±0.7 mV(n=13,P<0.05)。⑷蛙皮素使NPY神經(jīng)元的輸入電阻減少22.4±5.7％(n=8,P<0.05)。內(nèi)向電流顯示其反轉(zhuǎn)電位在-18.3±3.4 mV。⑸電極內(nèi)液中加入BAPTA(10 mM)后,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神經(jīng)元膜電位去極化作用減少到2.0 mV±0.6 mV(n=5,P<0.05)。使用無鈣細胞外液時,

8、蛙皮素(250 nM)引起的NPY神經(jīng)元膜電位去極化作用增加到9.0±1.4 m3/(n=5,P<0.05)。在細胞外液中加入瞬時感受器電位(transient receptorpotential,TRP)通道阻斷劑SKF96365(30μM)后,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神經(jīng)元膜電位去極化作用減少到2.7 mV±0.6 mV(n=5,P<0.05)。在細胞外液加入NiCl2(3 mM)后,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神經(jīng)

9、元膜電位去極化作用減少到2.4±0.7 mV(n=5,P<0.05)。在細胞外液加入鈉.鈣交換泵阻斷劑KB-R7943(60μM)后,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神經(jīng)元膜電位去極化作用減少到2.3±0.9mV(n=6,P<0.05)。⑹水迷宮實驗中,缺血組大鼠在目標象限停留的時間(ischemia:24.7±3.8％；sham:37.8±6.1％:ischemia+bombesin:35.5±3.6％)顯著縮短。而假手術(shù)組(P<0

10、.05,ischemiavs sham)和蛙皮素組(P<0.05,ischemia vs ischemia+bombesin)停留時間較長。⑺在體LTP實驗中,缺血組大鼠標準化的群峰電位的斜率明顯減少(ischemia:114.0±3.1％；sham:129.8±4.5％,P<0.05),而在蛙皮素組,標準化的群峰電位的斜率與假手術(shù)組無顯著差異(ischemia+bombesin:125.8±4.3％,P>0.05 vs sham；P<

11、0.05 vs ischemia)。⑻電壓鉗實驗中,給予蛙皮素(250HM)后,鈉電流幅值變?yōu)樵瓉淼?3.32±5.98％(n=6,P<0.05),而洗脫后電流幅值恢復到原來的97.55±2.19％(n=6,P>0.05)。
　　 結(jié)論：①蛙皮素能夠可逆的興奮NPY神經(jīng)元和POMC神經(jīng)元,并且具有濃度依賴性。②蛙皮素興奮NPY神經(jīng)元的機制可能來自激活非選擇性陽離子通道和鈉-鈣交換泵。③蛙皮素能夠改善雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎腦缺血大鼠模型