急性分離大鼠下丘腦神經(jīng)元自發(fā)性放電觸發(fā)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景 細(xì)胞溫度敏感機(jī)制是目前環(huán)境生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)圍繞溫度敏感的分子感受和調(diào)控機(jī)制，研究者從多個(gè)方面進(jìn)行了探索，包括鉀通道、瞬時(shí)受體電位通道、氨基酸類受體(包括谷氨酸受體和γ-氨基丁酸受體)、內(nèi)生阿片樣受體、ATP受體蛋白等都有參與，這些分子主要參與對(duì)細(xì)胞放電幅度和頻率、對(duì)周圍系統(tǒng)的產(chǎn)熱和散熱系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。但總的來(lái)說(shuō)，目前對(duì)于這些調(diào)控分子的研究還處于起步階段，可能還存在一些關(guān)鍵的調(diào)控分子尚未得到重視或發(fā)現(xiàn)。下丘

2、腦，特別是視前區(qū)/前部下丘腦(Preopticandanteriorhypothalamus，PO/AH)中的神經(jīng)元參與了多種機(jī)體活動(dòng)，例如溫度調(diào)控、飲食行為等等，在眾多的功能之中，其作為機(jī)體感受溫度變化并調(diào)控相應(yīng)反應(yīng)的中樞器官尤其為人們所重視及認(rèn)同。 可改變神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢粫r(shí)程的因素均有參與神經(jīng)元的溫度敏感機(jī)制形成的可能性，例如超極化激活環(huán)核苷酸門控離子通道(hyperpolarization-activated，cyclic

3、nucleotide-gatedchannels，HCNchannel)可由細(xì)胞膜電位的超極化而激活，造成胞外Na+及K+內(nèi)流，從而使膜電位有去極化的趨勢(shì)，進(jìn)而影響細(xì)胞AP。加上下丘腦中表達(dá)有HCN通道的事實(shí)，使得對(duì)下丘腦溫度敏感機(jī)制的研究又增添了新的線索。 下丘腦對(duì)于機(jī)體溫度感受及調(diào)節(jié)的重要性早已獲得公認(rèn)，然而由于下丘腦組織含有種類繁多、性質(zhì)各異的神經(jīng)元，加上各種神經(jīng)元之間相互的作用，使得在整體動(dòng)物及腦片上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究涉及

4、到太多的影響因素及作用機(jī)制；而另一方面，亦有研究人員對(duì)培養(yǎng)狀態(tài)下的下丘腦PO/AH神經(jīng)元電生理特性及溫度敏感性進(jìn)行了研究，但是培養(yǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞面對(duì)著與體內(nèi)截然不同的內(nèi)環(huán)境，其細(xì)胞性狀及特性還有基因表達(dá)等等均會(huì)產(chǎn)生或多或少的改變，因此從培養(yǎng)神經(jīng)元獲得的實(shí)驗(yàn)資料并不能準(zhǔn)確地反映其在體內(nèi)真實(shí)性狀。因此有必要對(duì)急性分離的下丘腦神經(jīng)元電生理特性進(jìn)行研究，以使人們對(duì)下丘腦的認(rèn)識(shí)更加全面。 HCN通道功能的紛繁復(fù)雜，不同種類細(xì)胞中HCN通道

5、的特性也各不相同，變化多端，相當(dāng)多的研究已揭示下丘腦組織區(qū)域表達(dá)有豐富的HCN通道，然而對(duì)下丘腦神經(jīng)元的電生理特性中HCN通道的功能卻少有研究涉及。 目的 1.探討急性分離的大鼠下丘腦神經(jīng)元自發(fā)放電特性以及其溫度敏感性。 2.研究HCN通道各亞型mRNA在相應(yīng)單個(gè)自發(fā)放電神經(jīng)元中的表達(dá)情況。 3.探索下丘腦神經(jīng)元的溫度敏感內(nèi)在機(jī)制以及其與HCN通道之間的聯(lián)系，從而為下丘腦溫度感應(yīng)及調(diào)控機(jī)制研究找到

6、新的線索。 方法 1.利用酶消化下丘腦腦片及機(jī)械分離方法獲得急性分離的神經(jīng)元，為后繼實(shí)驗(yàn)提供狀態(tài)良好的神經(jīng)元。 2.采用全細(xì)胞模式膜片鉗記錄大鼠下丘腦神經(jīng)元的自發(fā)放電活動(dòng)及Ih電流，明確其電生理特性并施加溫度影響。 3.采用單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)檢測(cè)前述電生理實(shí)驗(yàn)確定的各類型神經(jīng)元中HCN通道m(xù)RNA的表達(dá)情況，并利用限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)來(lái)驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性 結(jié)果 1.利用

7、酶消化下丘腦腦片及機(jī)械分離方法可成功獲得急性分離的神經(jīng)元，神經(jīng)元狀態(tài)良好，可保證后繼實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 2.在總共記錄的78個(gè)下丘腦神經(jīng)元之中，共記錄到12個(gè)自發(fā)放電的神經(jīng)元，其余均為非自發(fā)放電神經(jīng)元。二者膜電容及輸入阻抗無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 3.下丘腦神經(jīng)元的自發(fā)放電可以由自發(fā)去極化或前電位(包括EPSP)觸發(fā)，可據(jù)此將自發(fā)放電的神經(jīng)元分為兩類，即自發(fā)去極化神經(jīng)元(spontaneousdepolarizing

8、neuron，SDN)和前電位驅(qū)動(dòng)神經(jīng)元(prepotential-drivenneuron，PPDN)。 4.SDN與PPDN靜息膜電位及輸入阻抗無(wú)顯著差別，而PPDN突觸后電位(post-synapticpotential，PSP)發(fā)生的頻率則顯著高于SDN(P＜0.05)。 5.下丘腦神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢怀蕰r(shí)間依賴性的衰減，可能與采用全細(xì)胞記錄模式有關(guān)。由于這種模式通常破壞了細(xì)胞膜的完整性，隨著記錄時(shí)間的延長(zhǎng)，胞內(nèi)成

9、分逐漸與電極內(nèi)液交換，這就造成了胞內(nèi)離子成分被電極內(nèi)液替代，這可能是動(dòng)作電位時(shí)間依賴性衰減的最大原因。 6.下丘腦中對(duì)溫度敏感及不敏感的SDN和PPDN均有存在。 7.注射電流的大小對(duì)EPSP驅(qū)動(dòng)神經(jīng)元的放電頻率及幅度基本不會(huì)產(chǎn)生影響；對(duì)SDN放電頻率有影響，注射電流越大，單位時(shí)間內(nèi)神經(jīng)元放電頻率增加，但幅度降低。注射電流對(duì)SDN和EPSP驅(qū)動(dòng)神經(jīng)元放電峰電位亦有影響，SDN峰電位隨著放電次數(shù)增加而降低，而EPSP驅(qū)

10、動(dòng)神經(jīng)元峰電位無(wú)明顯變化。 8.全細(xì)胞模式下自發(fā)放電大鼠下丘腦神經(jīng)元上可記錄到Ih電流，應(yīng)用特異的HCN通道阻斷劑ZD7288可將ZD7288敏感電流分離出來(lái)；而Ih的降低可導(dǎo)致IA增強(qiáng)。 9.ZD-7288阻斷Ih電流后不同類型神經(jīng)元放電產(chǎn)生了不同變化，反映了Ih電流在神經(jīng)元溫度敏感機(jī)制中的作用。ZD7288可降低自發(fā)去極化的WSN放電頻率及電位幅度，阻斷EPSP驅(qū)動(dòng)的WSN自發(fā)放電，而對(duì)自發(fā)去極化及EPSP驅(qū)動(dòng)的

11、TIN無(wú)顯著影響。利用SC-RT-PCR方法在每類神經(jīng)元中均檢測(cè)到了HCN1、HCN2、HCN3mRNA的表達(dá)，但未檢測(cè)到HCN4mRNA。進(jìn)一步的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)亦證實(shí)了SC-RT-PCR的特異性。 結(jié)論 1.急性分離的大鼠下丘腦神經(jīng)元根據(jù)其放電觸發(fā)機(jī)制可分為前電位驅(qū)動(dòng)神經(jīng)元及自發(fā)去極化神經(jīng)元兩類。 2.全細(xì)胞模式下大鼠下丘腦神經(jīng)元上可記錄到Ih電流，而Ih的降低可導(dǎo)致IA增強(qiáng)，從而可改變放電頻率。