大劑量gc對下丘腦神經(jīng)元[ca39;2],i的影響及其機制研究

1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文大劑量GC對下丘腦神經(jīng)元[Ca]的影響及其機制研究姓名：王旭輝申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：周繼紅20090501第二軍醫(yī)人學(xué)碩十學(xué)位論文2 p M 的毒胡蘿卜素常溫預(yù)處理5 m i n ；K B —R 7 9 4 3 組神經(jīng)元使用2 0 “M 的K B ．R 7 9 4 3 預(yù)處理l O m i n ；p H 8 ．8 緩沖液組神經(jīng)元使用p H 8 ．8 細胞外緩沖液預(yù)處理l O m i n ，然后

2、加入D E x ( 終濃度l O 擊M ) 。使用F l u o ．3 ／A M 鈣熒光探針標記細胞內(nèi)游離鈣離子，激光共聚焦顯微鏡記錄加入D E X 前后神經(jīng)元內(nèi)鈣熒光變化。4 ．大劑量D E X 致下丘腦神經(jīng)元【C a 2 + 】i 下降的信號通路研究實驗分為以下4 個組：l O 。6 M D E x 組，p H 值8 。8 的細胞外緩沖液處理+ l O 與M D E X組，鹽酸屈菜紅堿預(yù)處理預(yù)處理( 阻斷P K C ) + l O

3、巧M D E X 組，M D L —1 2 3 3 0 A 預(yù)處理( 阻斷P K A ) + l O 曲MD E X 組。P K A 和P K C 阻斷劑預(yù)處理時間均為1 5 m i n ，然后加入D E x ( 終濃度1 0 由M ) 進行刺激。用F l u o 一3 ／A M 鈣熒光探針標記細胞內(nèi)游離鈣離子，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光變化。結(jié)果1 ．將改進后的神經(jīng)元培養(yǎng)方法應(yīng)用于培養(yǎng)下丘腦神經(jīng)元，結(jié)果顯示新方法培養(yǎng)的神經(jīng)元生長迅

4、速，膠質(zhì)細胞少，3 —7 天之問神經(jīng)元形態(tài)飽滿，胞體直徑，突起長度，均達高峰，且無過于廣泛的突觸連接和膠質(zhì)細胞生長，為進行觀察實驗的最佳時期。2 ．本部實驗證明：在無鈣的細胞外環(huán)境下，1 0 自M 的D E X 可以導(dǎo)致下丘腦神經(jīng)元【C a 2 + 】i 迅速下降了2 0 ．5 ±9 ．9 ％。這種現(xiàn)象可以被G C 的胞漿受體( i G R ) 阻斷劑R U ．4 8 6阻斷，提示i G R 參與了1 0 ‘6 M D E X

5、 所導(dǎo)致的下丘腦神經(jīng)元【C a 2 + 】i 下降。3 ．使用p H 值為8 ．8 的細胞外液阻斷P M c A 的活動，可以完全阻斷G c 介導(dǎo)的下丘腦神經(jīng)元內(nèi)【c a 2 + 】i 下降現(xiàn)象，提示大劑量G C 可以通過是通過迅速激活P M C A 清除下丘腦神經(jīng)元內(nèi)鈣離子，從而導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)【c a 2 + 】i 快速下降。而s E R c A 和N c x 的阻斷劑并不能阻斷D E x 介導(dǎo)神經(jīng)元【C a 2 + 】i 下降，說明二

6、者并未參與其中。4 ．本實驗使用鹽酸屈菜紅堿抑制P K C 活性、用腺苷酸環(huán)化酶( A c ) 的抑制劑M D L 一1 2 3 3 0 A 阻斷P K A 信號途徑。阻斷P K C 信號通路后，完全抑制了1 0 擊M 的D E X所介導(dǎo)的下丘腦神經(jīng)元【C a 2 + 】i 的下降現(xiàn)象。而阻斷P K A 則不能阻斷這一過程。提示P K C 途徑參了1 0 曲M 的D E x 介導(dǎo)的引發(fā)下丘腦神經(jīng)元【C a 2 + 】i 下降。結(jié)論上述實