胰島素、瘦素對大鼠下丘腦NPY神經(jīng)元大電導鈣激活鉀通道的調(diào)節(jié)及機制.pdf

1、下丘腦是神經(jīng)-內(nèi)分泌兩大機能系統(tǒng)的結(jié)合點，在維持機體生命活動和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要的作用。由脂肪細胞分泌的瘦素（leptin）與胰島β細胞分泌的胰島素（insulin）在下丘腦的神經(jīng)-內(nèi)分泌反饋環(huán)路中起到將外周信號傳入下丘腦的作用。它們作用于下丘腦中樞，通過改變神經(jīng)元的電興奮性來調(diào)節(jié)某些特定的效應神經(jīng)元，如神經(jīng)肽Y（NPY）神經(jīng)元的生理功能。大電導鈣激活鉀通道（large conductance calcium-activated pot

2、assium channels，BK通道）是眾多K+通道中的一種，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中廣泛分布于樹突，軸突，突觸末端，以及神經(jīng)元胞體。在細胞發(fā)生動作電位期間，通道可以被膜的去極化和細胞內(nèi)Ca2+水平的增高所激活，其直接效應是產(chǎn)生快后超極化電位。因此，通道的作用主要是使神經(jīng)元動作電位的時程維持在正常范圍內(nèi)，使神經(jīng)元放電頻率減少，降低神經(jīng)元的興奮性，從而最終影響神經(jīng)沖動的傳導以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。通道功能特性的改變，將對神經(jīng)元的活動和腦

3、的正常功能產(chǎn)生重要影響。然而，下丘腦內(nèi)NPY神經(jīng)元散在分布的特點使得很難對單個神經(jīng)元電生理活動進行觀察。為了研究這一類神經(jīng)元的內(nèi)在活動及其對insulin和leptin的電生理反應，通過建立將形態(tài)學特征與免疫細胞化學技術(shù)相結(jié)合的方法來鑒定NPY神經(jīng)元，并運用全細胞膜片鉗技術(shù)，研究insulin和leptin對BK通道的作用及其機制。 第一部分、Insulin對培養(yǎng)大鼠下丘腦NPY神經(jīng)元BK通道的影響及機制。 目的：NPY

4、神經(jīng)元是下丘腦內(nèi)調(diào)節(jié)攝食和能量代謝的主要效應細胞，大量研究已證實，insulin能夠抑制NPY神經(jīng)元的活性。BK通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞興奮性上發(fā)揮了重要作用。本實驗通過研究insulin對NPY神經(jīng)元BK通道的作用，探討insulin調(diào)控這類神經(jīng)元興奮性的電生理機制。 方法： （1）采用免疫細胞化學技術(shù)鑒定與攝食相關(guān)的NPY神經(jīng)元。 （2）結(jié)合形態(tài)學特征，采用全細胞膜片鉗技術(shù)及及記錄后的再次鑒定比對，研究insuli

5、n對這類神經(jīng)元BK通道的調(diào)節(jié)作用及其可能的信號通路。 結(jié)果： （1）NPY神經(jīng)元具有明顯形態(tài)學特征，典型的NPY神經(jīng)元細胞體較小，成三角形或紡錘形，大部分具有1-3個細小的，不分枝的一級樹突。 （2）Insulin （0.1-30 nM）濃度依賴性地增加BK電流。3nM insulin在膜電位為+20-+60mV時可使BK電流的I-V曲線顯著上移，并且能夠使BK通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線左移。 （3）Insuli

6、n對BK電流的增大作用能夠被其受體阻斷劑以及磷脂酰肌醇3激酶（PI3-k）阻斷劑所抑制，而不受絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）阻斷劑的影響。 結(jié)論：Insulin可濃度依賴性地增加BK通道電流，且這種作用是通過IR介導的PI3-k途徑實現(xiàn)。 第二部分、Leptin對培養(yǎng)大鼠下丘腦NPY神經(jīng)元BK通道的影響及機制。 目的：生理狀態(tài)下，leptin發(fā)揮著與insulin相似的功能，CNS中l(wèi)eptin同樣能夠抑制NPY

7、神經(jīng)元的活性。本實驗通過研究leptin對NPY神經(jīng)元BK通道的作用，探討leptin調(diào)控這類神經(jīng)元興奮性的電生理機制，觀察leptin對NPY神經(jīng)元BK通道的作用是否與insulin類似。 方法： （1）采用免疫細胞化學技術(shù)鑒定NPY神經(jīng)元。 （2）結(jié)合形態(tài)學特征，采用全細胞膜片鉗技術(shù)及及記錄后的再次鑒定比對，研究leptin對這類神經(jīng)元BK通道的調(diào)節(jié)作用及其信號通路。 結(jié)果： （1）Lepti

8、n對NPY神經(jīng)元BK通道的影響與insulin極其類似。Leptin（1.0-300nM）濃度依賴性地增加NPY神經(jīng)元BK電流。30nM leptin在膜電位為+20 mV-+60 mV時可使BK電流的I-V曲線顯著上移，而對通道的電壓依賴的激活特性以及激活閾電位沒有影響。30nM leptin還能夠使BK通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線左移，而對曲線斜率沒有顯著影響。 （2）leptin受體（LEPR）-門神激酶2（JAK2）-PI3-k信

9、號通路阻斷劑能夠抑制leptin引起的NPY神經(jīng)元BK電流的增大，而MAPK阻斷劑則不產(chǎn)生影響。 結(jié)論：Leptin可濃度依賴性地增加BK通道電流，且這種作用是通過LEPR介導的PI3-k途徑實現(xiàn)。 第三部分、Insulin及l(fā)eptin對培養(yǎng)大鼠下丘腦NPY神經(jīng)元BK通道的相互作用。 目的：生理環(huán)境中，insulin和leptin共同存在于下丘腦部位發(fā)揮生理作用，且大量研究表明這兩類激素在下丘腦的信號轉(zhuǎn)導通路之

10、間存在著交叉對話。因此本實驗觀察insulin和leptin共同存在時對NPY神經(jīng)元BK通道的作用，以及激素之間的相互影響。 方法： （1）采用免疫細胞化學技術(shù)鑒定NPY神經(jīng)元。 （2）結(jié)合形態(tài)學特征，采用全細胞膜片鉗技術(shù)及記錄后的再次鑒定比對，研究insulin和leptin共同作用于NPY神經(jīng)元BK通道的效果以及一種激素預孵育是否會對另一種激素的作用產(chǎn)生影響。 結(jié)果： （1）外液中同時加入3n

11、M insulin和30nM leptin顯著增大NPY神經(jīng)元BK電流幅值，且增大作用同樣可以被PI3-k阻斷劑抑制。然而兩種激素共同作用的效果與3nM insulin或30nM leptin單獨作用時的效果相近，并未出現(xiàn)疊加效應。 （2）3nM insulin預孵育神經(jīng)元5min后再觀察30nM leptin對BK電流的作用，發(fā)現(xiàn)insulin預孵育后的神經(jīng)元對leptin失去反應性。同樣，用30nM leptin預孵育的神經(jīng)