胰島素樣生長因子-1對下丘腦神經(jīng)元鈣信號的調(diào)節(jié)及機制.pdf

1、下丘腦是神經(jīng)-內(nèi)分泌兩大機能系統(tǒng)的結(jié)合點，整合、處理體內(nèi)大量生長信號和代謝信號，在維持機體正常生命活動和內(nèi)環(huán)境恒定中發(fā)揮重要的作用。研究表明機體衰老過程中，首先會出現(xiàn)內(nèi)分泌功能的紊亂，因此有學者認為下丘腦在調(diào)節(jié)衰老的進程中起著重要作用。衰老的鈣失衡假說認為，衰老伴隨有神經(jīng)元胞漿內(nèi)鈣離子濃度（[Ca2+]I）穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制的失調(diào)，衰老可通過多種機制導致神經(jīng)元[Ca2+]I異常升高，這些內(nèi)鈣調(diào)節(jié)機制的異常又進一步影響突觸傳遞、遞質(zhì)釋放和信號轉(zhuǎn)

2、導過程，促進衰老的發(fā)展。
　　 胰島素樣生長因子-1（Insulin-like growth factor-1，IGF-1）與IGF-2、胰島素具有相似的結(jié)構和功能，參與調(diào)節(jié)糖、能量代謝和生長。IGF-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用。已有研究顯示，IGF-1能影響下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能。下丘腦弓狀核的神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y，NPY)神經(jīng)元參與調(diào)節(jié)代謝、生長、生殖和食欲。IGF-

3、1可通過作用于NPY神經(jīng)元（影響NPY的合成和釋放），發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用。鈣離子在調(diào)節(jié)細胞活性、激素的合成與釋放中扮演著重要角色，而IGF-1對下丘腦神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣信號的調(diào)節(jié)作用，特別是對電壓依賴性鈣通道（voltage-gated calcium channels，VGCCs）的作用尚未見報道。
　　 長時間培養(yǎng)的細胞在一定程度上可以反映在體細胞的衰老、退化過程。因此本研究用長時間培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元，模擬神經(jīng)元發(fā)育、成熟與

4、衰老的全過程，采用全細胞膜片鉗技術，結(jié)合形態(tài)學觀察及免疫組化的鑒定，研究生理濃度的IGF-1對長時間培養(yǎng)的下丘腦NPY神經(jīng)元VGCCs的調(diào)節(jié)作用及其這種作用的機制。實驗結(jié)果顯示，IGF-1預孵育24小時能顯著增加NPY神經(jīng)元的高電壓激活鈣電流（high voltage-activated calcium currents，IHVA）的幅值，這種增強作用能被磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylino 3-kinase，PI3-K）的

5、抑制劑所阻斷，而且L-型鈣通道的阻斷劑nifedipine也能明顯抑制這種作用。IGF-1的這種調(diào)節(jié)作用在培養(yǎng)的中期較早期和后期明顯。激光共聚焦免疫熒光雙標實驗顯示IGF-1可使NPY神經(jīng)元上L-型鈣通道的表達上調(diào)。這些結(jié)果表明IGF-1通過激活PI3-K增加NPY神經(jīng)元的IHVA，其中L-型鈣通道是介導IGF-1神經(jīng)元調(diào)節(jié)作用的主要鈣通道亞型，鈣通道表達的變化可能參與了IGF-1的作用。
　　 第一部分：IGF-1對不同培養(yǎng)時

6、間的下丘腦NPY神經(jīng)元電壓依賴性鈣電流的作用
　　 目的：在衰老的神經(jīng)-內(nèi)分泌學說中，認為下丘腦是衰老的起步點。長時間培養(yǎng)的細胞在一定程度上反映在體細胞的衰老、退化過程。IGF-1和NPY都能調(diào)節(jié)代謝、生殖并有神經(jīng)保護作用。IGF-1可通過影響NPY的合成及釋放，調(diào)節(jié)下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，進而參與調(diào)節(jié)衰老進程。VGCCs在調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放中發(fā)揮著重要作用。在本部分實驗中，我們觀察了生理濃度的IGF-1對下丘腦

7、NPY神經(jīng)元IHVA的作用以及這種作用與體外培養(yǎng)時間之間的關系。
　　 方法：(1)采用免疫組化的方法鑒定下丘腦NPY神經(jīng)元。(2)結(jié)合形態(tài)學特征及記錄后的再次鑒定比對，應用全細胞膜片鉗技術觀察IGF-1對不同培養(yǎng)時間的下丘腦NPY神經(jīng)元IHVA的作用。
　　 結(jié)果：(1)NPY神經(jīng)元在形態(tài)上具有明顯的特點，典型的NPY神經(jīng)元細胞體較小，成三角形或紡錘形，大部分具有1-3個細小的、不分枝的一級樹突。(2)IGF-1能增加

8、各個培養(yǎng)時期的NPY神經(jīng)元的IHVA，其調(diào)節(jié)作用在培養(yǎng)中期（DIV 7d和14d）最大，培養(yǎng)的早期和晚期，調(diào)節(jié)作用均明顯降低。
　　 結(jié)論：IGF-1對VGCCs的抑制或活化能調(diào)節(jié)相應神經(jīng)元的興奮性及功能，這可能是IGF-1神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用的機制之一。
　　 第二部分：IGF-1對下丘腦NPY神經(jīng)元電壓依賴性鈣通道的作用及其機制
　　 目的：下丘腦NPY神經(jīng)元參與調(diào)節(jié)代謝、生長、生殖和食欲。IGF-1可通過作用

9、于NPY神經(jīng)元（影響其合成和釋放），而發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用。VGCCs在調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放中發(fā)揮著重要作用。在本部分實驗中，我們進一步觀察生理濃度的IGF-1對體外培養(yǎng)7d的NPY神經(jīng)元VGCCs的作用，并探討IGF-1調(diào)控這類神經(jīng)元VGCCs的機制。
　　 方法：(1)采用免疫組化方法鑒定NPY神經(jīng)元。(2)結(jié)合形態(tài)學特征，采用全細胞膜片鉗技術及記錄后的再次鑒定比對，進一步觀察IGF-1對體外培養(yǎng)7d的NPY

10、神經(jīng)元VGCCs的作用并探討其信號調(diào)節(jié)通路。(3)應用激光共聚焦免疫熒光雙標方法，觀察IGF-1對NPY神經(jīng)元上鈣通道表達的影響。
　　 結(jié)果：(1)NPY神經(jīng)元在形態(tài)上具有明顯特點，典型的NPY神經(jīng)元細胞體較小，成三角形或紡錘形，大部分具有1-3個細小的、不分枝的一級樹突。(2)IGF-1增加NPY神經(jīng)元的IHVA，使穩(wěn)態(tài)激活曲線稍向超級化方向移動，但不改變穩(wěn)態(tài)失活曲線。IHVA的增加能被PI3-K的抑制劑明顯減弱，而且可被L