類固醇激素對雞胚下丘腦神經(jīng)元增殖調(diào)控的研究.pdf

1、下丘腦是生物機(jī)體內(nèi)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌中樞，控制著機(jī)體眾多生理活動。在下丘腦一垂體一性腺軸(HPG)中，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)調(diào)節(jié)腺垂體分泌促性腺激素，即卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)，二者又可刺激性腺分泌性激素，包括雌二醇(E<,2>)和睪酮(T)，同時性激素又能對下丘腦的激素分泌起到反饋調(diào)節(jié)作用，因此性腺與下丘腦之間存在著密切的聯(lián)系。本實驗選用雞胚下丘腦，采用神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型來研究性激素對下丘腦神經(jīng)元增

2、殖的影響，并探討其機(jī)理。 本實驗建立了17胚齡雞下丘腦神經(jīng)元一膠質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型。在原代培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)細(xì)胞中，選用添加2.5％去類固醇血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)3d后將培養(yǎng)液更換成添加10μg/mL胰島素、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10<'-8>mol/L亞硒酸鈉的無血清DMEM，即ITS培養(yǎng)液，以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的過度增殖、排除血清中的復(fù)雜成分對下一步實驗的干擾。該培養(yǎng)體系中神經(jīng)元胞體飽滿，兩端有突起；膠質(zhì)細(xì)胞胞體扁平，呈不

3、規(guī)則狀。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性：膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色呈陽性。在此共培養(yǎng)模型中神經(jīng)元具有良好的增殖活性且能存活兩周以上。 利用所建立的體外培養(yǎng)模型研究了性激素對下丘腦神經(jīng)元增殖的調(diào)控作用。用17β一雌二醇(E<,2>，10<'-8>-10<'-6>mol/L)和睪酮(T，10<'-8>-10<'-6>mol/L)處理培養(yǎng)的細(xì)胞， 48h后觀察神經(jīng)元數(shù)目變化并用PCNA免疫細(xì)胞化學(xué)顯

4、示細(xì)胞的增殖活性，計算神經(jīng)元的PCNA標(biāo)記率(PCNA-LI)，并通過雌激素受體(ER)免疫細(xì)胞化學(xué)染色統(tǒng)計ER陽性的神經(jīng)元數(shù)目。結(jié)果顯示：E<,2>(10<'-8>-10<'-6>mol/L)顯著促進(jìn)神經(jīng)元的增殖，PCNA染色較對照組深，且神經(jīng)元陽性率也顯著高于對照組。雌激素受體阻斷劑他莫西芬(TMX，10<'-8>-10<'-6>mol/L)能抑制E<,2>的促增殖作用。此外，對兩種性別比較發(fā)現(xiàn)，E<,2>均能促進(jìn)雌雄雞胚下丘腦神經(jīng)

5、元的增殖，且高濃度的E<,2>(10<'-7>-10<'-6>mol/L)對雌性的促增殖作用強(qiáng)于雄性。T(10<'-7>-10<'-6>mol/L)顯著促進(jìn)了雄性雞胚下丘腦神經(jīng)元的增殖，而在雌性，僅高濃度的T(10<'-6>mol/L)可顯著促進(jìn)神經(jīng)元的增殖。E<,2>、T處理后ER陽性神經(jīng)元數(shù)目顯著高于對照組。上述結(jié)果提示：性激素可通過上調(diào)雌激素受體表達(dá)等途徑促進(jìn)胚胎期下丘腦神經(jīng)元的增殖。 在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究T促進(jìn)神經(jīng)元增殖

6、作用的機(jī)理。雄性雞胚下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞用T(10<'-6>mol/L)處理，并同時添加雄激素受體阻斷劑氟他胺(FLU)、TMX以及芳香化酶阻斷劑來曲唑(LET)。48h后通過統(tǒng)計神經(jīng)元數(shù)目、PCNA和BrdU免疫細(xì)胞組化染色來定量細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示：FLU(100-1000ng/mL)、TMX(10<'-8>-10<'-6>mol/L)以及LET(10<'-8>-10<'-6>mol/L))均能阻斷睪酮的促神經(jīng)元增殖作用。FLU、T

7、MX、LET與T聯(lián)合處理組PCNA-LI和BrdtJ-LI均低于T單獨處理組。以上結(jié)果提示：T 的促增殖作用是通過雌激素樣作用和雄激素樣作用實現(xiàn)的。 上述結(jié)果表明：① 17胚齡雞下丘腦神經(jīng)元一膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型對激素作用敏感，可用于評價外源激素、藥物等對神經(jīng)元增殖作用的研究。② E<,2>對胚胎期下丘腦神經(jīng)元具有顯著的促增殖作用，同時上調(diào)ER的表達(dá)。③ T 顯著促進(jìn)胚胎期下丘腦神經(jīng)元的增殖，且睪酮對雄性的促增殖作用更為敏感。