慢性應(yīng)激肝郁脾虛模型大鼠下丘腦弓狀核攝食相關(guān)神經(jīng)肽變化機(jī)制研究.pdf

1、目的:在前期實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，本課題通過慢性束縛應(yīng)激方法來建立肝郁脾虛證候動(dòng)物模型，以免疫熒光雙染、激光共聚焦成像、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)等技術(shù)與方法，從基因與蛋白水平，分析下丘腦弓狀核（Arcuate nucleus，ARC）中具有抑制攝食作用的瘦素受體(ob-R)、可卡因-安非它明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(Cocaine amph-etamine-regulated transc

2、ript，CART)、前阿黑皮(Proopiomelanocortin，POMC)、α-促黑素細(xì)胞激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)的表達(dá)，為肝郁脾虛證候機(jī)體所表現(xiàn)的食欲下降、體重減輕、便溏等脾胃運(yùn)化功能失常的生物學(xué)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù);同時(shí)以中藥復(fù)方逍遙散（《太平惠民和劑局方》）作為干預(yù)用藥，揭示其疏肝解郁、健脾以調(diào)節(jié)食欲的作用靶點(diǎn)與機(jī)理。
　　方法:SD大鼠隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照

3、組（簡(jiǎn)稱正常組）、7天模型組、21天模型組、逍遙散組。正常組大鼠不施加應(yīng)激措施，正常飼養(yǎng);7天模型組、21天模型組大鼠分別予每天連續(xù)3h、連續(xù)7天、21天的慢性束縛應(yīng)激方法（將大鼠束縛固定于特制的T型臺(tái)）建立動(dòng)物模型;逍遙散組大鼠慢性束縛應(yīng)激21天同時(shí)予灌服中藥復(fù)方逍遙散。7天模型組于實(shí)驗(yàn)第8天取材;正常組、21天模型組與逍遙散組于實(shí)驗(yàn)第22天取材。動(dòng)態(tài)觀測(cè)4組大鼠體重、攝食量、飲水量、外觀表征和行為學(xué)變化（曠場(chǎng)試驗(yàn)、高架十字試驗(yàn)）。以

4、免疫熒光雙染、激光共聚焦成像、RT-qPCR等技術(shù)與方法，觀測(cè)大鼠下丘腦ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH基因和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1大鼠一般外觀表征與行為學(xué)的變化
　　與正常組大鼠比較，模型組大鼠體重、攝食量、飲水量呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì);一般外觀表現(xiàn)出現(xiàn)嗜睡懶動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、皮毛枯黃晦暗、耳廓爪部色澤變淡、大便干濕不調(diào)等變化;在束縛造模第0天，曠場(chǎng)試驗(yàn)各組大鼠5min內(nèi)總穿格數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、站立次

5、數(shù)、修飾次數(shù)基本處于同一水平，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，模型組大鼠的中央?yún)^(qū)停留時(shí)間明顯增加，總穿格數(shù)、站立次數(shù)、修飾次數(shù)呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。高架十字試驗(yàn)各組大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)、開放臂停留時(shí)間、進(jìn)入封閉臂次數(shù)、封閉臂停留時(shí)間基本無差別，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，模型組大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)和開放臂停留時(shí)間呈下降趨勢(shì)，進(jìn)入封閉臂次數(shù)及封閉臂停留時(shí)間呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，而逍遙散組大鼠體重、攝食量、飲水量、行為學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)的改善比較明顯，一般外觀表征也有顯著改善作用。
　　2

6、免疫熒光雙染觀測(cè)各組大鼠下丘腦ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH蛋白表達(dá)變化
　　在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，隨著束縛的持續(xù)施加，21天模型組大鼠下丘腦ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH的表達(dá)陽性面積、平均光密度、積分光密度、陽性細(xì)胞數(shù)均較正常組增加，CART、POMC、a-MSH與ob-R共染面積的表達(dá)亦較正常組增加;灌服3周逍遙散后，各項(xiàng)指標(biāo)均有下降趨勢(shì)，尤以ob-R與CART明顯。
　　3 RT-qP

7、CR觀測(cè)各組大鼠下丘腦ARC中ob-R mRNA、CART mRNA、POMC mRNA、α-MSH mRNA表達(dá)變化
　　在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，隨著束縛的持續(xù)施加，21天模型組大鼠下丘腦ARC中ob-R mRNA的表達(dá)較正常組明顯增加（P＜0.01），但CART mRNA、POMC mRNA、α-MSH mRNA的表達(dá)較正常組增加，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。逍遙散可以下調(diào)大鼠下丘腦ARC中ob-R mRNA、CART mRNA、

8、POMC mRNA、α-MSH mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　121天模型組大鼠下丘腦ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH蛋白與基因處于高表達(dá)水平，尤以ob-R明顯，表明ob-R的蛋白與基因表達(dá)下降，是慢性應(yīng)激肝郁脾虛狀態(tài)機(jī)體出現(xiàn)食少、腹脹、便溏等脾胃失于健運(yùn)的主要內(nèi)在的中樞調(diào)節(jié)機(jī)制，7天模型組各指標(biāo)較正常組增加不明顯，表明慢性制動(dòng)束縛7天，模型以肝郁樣改變?yōu)橹鳌?br>　　2灌服逍遙散后，下丘腦ARC中ob