脂多糖對(duì)離體大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞TMEM16A的影響.pdf

1、目的:急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指非心源性的各種肺內(nèi)外因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸衰竭，急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratorydistress syndrome，ARDS）是急性肺損傷的嚴(yán)重階段，是一種常見危重癥，病死率極高。主要特征是肺泡毛細(xì)管膜損傷造成彌漫性肺損傷，導(dǎo)致肺泡與間質(zhì)內(nèi)聚積大量富蛋白的水腫液。臨床研究證實(shí)上皮細(xì)胞的損傷及肺泡液體清除力的下降是導(dǎo)致患者病死率升高的主要原因。因此減

2、輕早期肺泡上皮損傷程度、提高肺泡液體清除力可有利于ARDS的治療。
　　肺泡液體清除是一項(xiàng)綜合功能，主要通過活性離子通道及完整上皮細(xì)胞的物理屏障維持相對(duì)干燥的肺泡環(huán)境。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolarepithelial cells typeⅡ，ATⅡ)在肺泡液體清除方面發(fā)揮重要作用。離子和水跨肺泡上皮轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚未明確，研究表明鈉離子通道(ENaC)、Na+-K+-ATP酶(NKA)、水通道(AQP)均參與肺泡液體清除并發(fā)揮重要

3、作用。而氯離子通道對(duì)肺水清除的影響尚未完全清楚，已有研究證實(shí)囊性纖維化氣道跨膜調(diào)節(jié)子(cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)作為氯離子通道對(duì)肺泡液體清除發(fā)揮作用。2008年Schroeder等研究證實(shí)跨膜蛋白16A(TMEM16A)是鈣激活氯離子通道的分子基礎(chǔ)。有研究表明TMEM16A參與上皮細(xì)胞的分泌功能，Yang等利用免疫組化的方法確認(rèn)了TMEM16A在肺泡

4、上皮細(xì)胞中有表達(dá)，但是有關(guān)TMEM16A對(duì)急性肺損傷時(shí)肺泡液體清除影響的研究甚少。
　　脂多糖(LPS)是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分，LPS大量及持續(xù)釋放是引起ARDS發(fā)生、發(fā)展的重要因素。本實(shí)驗(yàn)通過LPS對(duì)離體大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞造成急性肺損傷模型，有助于進(jìn)一步研究TMEM16A對(duì)急性肺損傷時(shí)肺泡液體清除的影響，本實(shí)驗(yàn)研究目的在于:1、分離、純化大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞并進(jìn)行電鏡及染色鑒定。2、從炎癥因子的角度觀察LPS刺激體外培養(yǎng)的肺泡

5、Ⅱ型上皮細(xì)胞造成上清液中IL-8的變化。3、觀察不同時(shí)間及不同濃度LPS刺激肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞引起的TMEM16A的mRNA的變化。
　　方法:
　　1、選取清潔級(jí)健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只，體重為220±10g。按照Dobbs等提供的方法并適當(dāng)改進(jìn)分離大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(ATⅡ)，用IgG免疫粘附的方法純化分離的細(xì)胞，①臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力及細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。②用電鏡及AKP染色的方法鑒定ATⅡ

6、。③用AKP染色的方法測定ATⅡ純度。
　　2、建立脂多糖對(duì)分離的ATⅡ損傷模型。ATⅡ分離、純化后培養(yǎng)24 h，分三組:Ⅰ組（正常對(duì)照組）加入等容積培養(yǎng)基;Ⅱ組LPS終濃度1μg/ml;Ⅲ組LPS終濃度10μg/ml。分別測定刺激4h、8h后各組指標(biāo)的變化。①電鏡觀察比較各組ATⅡ超微結(jié)構(gòu)的變化。②用ELISA的方法檢測各組細(xì)胞上清液中IL-8表達(dá)水平。③用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測各組TMEM16AmRNA表達(dá)水平的差異。
　

7、　結(jié)果:
　　1、ATⅡ計(jì)數(shù)，鑒定及活力測定:細(xì)胞純化后每只大鼠可得細(xì)胞（1.84±0.14）×107個(gè)，細(xì)胞活力為(93.69±1.16)％。AKP染色法檢測純化后細(xì)胞純度為(84.66±1.47)％。電鏡檢測可證實(shí)提取細(xì)胞為ATⅡ。
　　2、透射電鏡檢測可證實(shí)ATⅡ急性損傷造模成功，可見細(xì)胞變性，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞表面微絨毛減少甚至消失，胞膜崩解，胞核固縮，胞質(zhì)內(nèi)各種細(xì)胞器明顯減少，板層小體出現(xiàn)排空及脫落，細(xì)胞空泡增多。<

8、br>　　3、用ELISA的方法檢測LPS損傷細(xì)胞的上清液中IL-8水平:體外培養(yǎng)的ATⅡ細(xì)胞經(jīng)LPS(1、10μg/ml)作用4h后IL-8水平與正常對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)，8h后差別依然存在。
　　4、用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測各組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞上TMEM16AmRNA表達(dá)結(jié)果:LPS濃度為1μg/ml組:在LPS刺激4h后TMEM16A的mRNA水平與對(duì)照組無明顯變化(P＞0.05)，在LPS刺激8h后TMEM16A的RNA水平與

9、對(duì)照組有所增加（P＜0.05），LPS濃度為10μg/ml組在LPS刺激4h及8h后:TMEM16A的mRNA水平與對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、本實(shí)驗(yàn)中原代大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分離提純方法可以得到足夠純度和活力的細(xì)胞，以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。脂多糖可以成功復(fù)制體外肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞急性損傷模型。
　　2、脂多糖單獨(dú)作用于體外培養(yǎng)的ATⅡ可使細(xì)胞上清液中IL-8表達(dá)水平增加。
　　3、 LPS