藶桃抗纖方對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響及作用機(jī)制.pdf

1、研究背景：肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是以運(yùn)動性呼吸困難進(jìn)行性加重，以喘息、氣短、干咳、喘憋為臨床表現(xiàn)，以限制性通氣功能障礙、低氧血癥、慢性進(jìn)行性彌漫性肺間質(zhì)纖維化為特點(diǎn)的肺間質(zhì)性疾病。肺纖維化既是多種肺疾病、多種系統(tǒng)性疾病的共同結(jié)局，又有無原發(fā)疾病的特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化。 近年來，隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)等生命科學(xué)理論研究，多種研究手段的應(yīng)用，從器官、組織、細(xì)胞、分子的不同層次，對肺纖維化的發(fā)生、診斷、防治

2、的研究不斷深入，取得極大的進(jìn)展。 研究表明，肺纖維化是由早期組織損傷、炎癥變化發(fā)展而來，而肺部受感染或損傷后，肺泡上皮細(xì)胞和是最早受到損傷的靶細(xì)胞。由于肺泡表面約93-97％的肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞為終末細(xì)胞，不能進(jìn)行分裂增殖，故具有增殖分化能力的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(Alveolar typeⅡ cell，ATⅡ)是參與組織損傷修復(fù)的主要細(xì)胞，所以，最初肺損傷后發(fā)生于組織修復(fù)時(shí)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial to

3、 mesenchymaltransition，EMT)在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用。 近年來隨著對肺纖維化的發(fā)病機(jī)理的深入研究，無論中、西醫(yī)均在治療上取得相當(dāng)進(jìn)展。導(dǎo)師在長期的臨床實(shí)踐中，依照經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立藶桃抗纖方，對肺間質(zhì)纖維化患者進(jìn)行霧化治療，取得了一定的療效．為了提高它的可信度和可重復(fù)性，為臨床實(shí)踐提供更好生命科學(xué)理論基礎(chǔ)，在本實(shí)驗(yàn)中，我們主要研究藶桃抗纖方對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、EMT轉(zhuǎn)化率以及對肺

4、泡Ⅱ型上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中相關(guān)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，在細(xì)胞及分子水平上探討藶桃抗纖方抗肺纖維化的生物學(xué)基礎(chǔ)。 目的：由于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)是發(fā)生肺纖維化的重要因素，故在本次實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowth factor TGF—β1)誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞系(A549)EMT發(fā)生，觀察TGF—β1對A549增殖及形態(tài)變化的影響，研究藶桃抗纖方霧滴干預(yù)后對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

5、的影響，從基于霧化中藥制劑影響EMT發(fā)生的角度，初步探討藶桃抗纖方防治肺纖維化的生物學(xué)基礎(chǔ)。 方法：使用不同濃度藶桃抗纖方體外干預(yù)A549細(xì)胞。免疫組化法檢測細(xì)胞內(nèi)TGF—β1的相對含量；通過TGF—β1體外誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的發(fā)生，ELISA法檢測細(xì)胞角蛋白(cytokeratin)及波形蛋白(vimentin)表達(dá)，計(jì)算細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化率；Real—time PCR法檢測藶桃抗纖方對細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的影響；we

6、stern Blot檢測細(xì)胞磷酸化(phosphorylation)Erk1/2的表達(dá)。 結(jié)果：不同濃度藶桃抗纖方體外作用A549細(xì)胞48h后，胞內(nèi)TGF—β1的定量表達(dá)，相較正常對照組明顯減少(40.35±1.65，37.84±0.95，37.45±0.78 VS45.13±2.01)，(P＜0.01)具有顯著差異性。TGF—β1體外誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT發(fā)生后，ELISA檢測細(xì)胞cytokeratin和vimentin表達(dá)顯

7、示，相較正常對照組，vimentin陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，而cytokeratin陽性表達(dá)相對減弱；RT—PCR檢測表明，A549細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)。經(jīng)不同濃度藶桃抗纖方體外作用誘導(dǎo)EMT成功的A549細(xì)胞48h后，與模型組相比，vimentin陽性表達(dá)出現(xiàn)不同程度的減弱，而cytokeratin陽性表達(dá)則出現(xiàn)不同程度增強(qiáng)；Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)均出現(xiàn)不同程度下調(diào)；phosphorylation Erk1/