腺病毒E1A蛋白對大鼠肺泡上皮細胞炎癥因子的影響及機制.pdf

1、兒童時期下呼吸道感染是慢性阻塞性肺疾病發(fā)病獨立的危險因素。下呼吸道感染的主要病原體是病毒，尤其是腺病毒。與其他病毒感染不同，腺病毒往往在急性期感染后形成潛伏感染狀態(tài)，病毒雖然停止復制但病毒DNA長期存在于宿主細胞內，并表達部分病毒蛋白，其中E1A蛋白是腺病毒潛伏感染后最主要表達的效應蛋白。COPD最主要的病理特征是累及肺組織和氣道的慢性炎癥，所涉及的發(fā)病機制主要包括：炎癥機制、氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及凋亡機制，構建了腺

2、病毒潛伏感染持續(xù)表達E1A蛋白的細胞模型，離體水平對E1A蛋白對細胞炎癥反應、細胞凋亡、氧化/抗氧化平衡、以及生理濃度糖皮質激素抗炎作用的影響等方面進行了研究。探討腺病毒潛伏感染在COPD發(fā)病機制中的作用，為進一步揭示COPD發(fā)病機制、尋找有效的COPD防治方法打下堅實基礎。 方法: 一、腺病毒E1A基因高效真核表達質粒的構建及穩(wěn)定表達E1A蛋白的大鼠肺泡上皮細胞株的構建：目的基因E1A編碼序列用PCR方法獲得，模板為含

3、有腺病毒C屬5型基因組25到1770核苷酸序列的質粒(Pneo-E1A)，將擴增的E1A基因片段連接到pGEM-Teasy載體上，酶切、測序鑒定正確后，亞克隆至高效真核表達質粒pCDNA<,3>、pEGFP-C<,2>上構建重組質粒pCDNA<,3>-E1A、pEGFP-C<,2>-E1A。最后對重組質粒進行酶切和測序鑒定。將構建成功的pCDNA<,3>-E1A、pEGFP-C<,2>-E1A重組質粒及對照質粒經脂質體轉染大鼠肺泡上皮細

4、胞，通過G418 抗性篩選和單克隆化操作最終獲得 4 個穩(wěn)定表達E1A蛋白的抗性細胞克隆，進一步用RCR、RT-PCR、Western-Blot及免疫組化的方法對E1A基因表達進行鑒定。細胞形態(tài)學觀察以及增殖曲線、流式細胞周期分析E1A蛋白對細胞形態(tài)學及增殖周期的影響。 二、腺病毒E1A基因對大鼠肺泡上皮細胞炎癥因子的影響及其機制：1、10m9．L<'-1>LPS和10pg．L<'-1>TNFα作用E1A陽性組細胞和對照組細胞，

5、分別于刺激因素作用24小時后收集細胞上清和細胞懸液進行細胞因子IL-6、TNFα、ICAM-1蛋白水平的測定；并于刺激因素作用前、作用后3、6、12小時收集細胞mRNA進行RT-PCR檢測IL-6、TNFα、ICAM-1 mRNA水平的表達。2、將轉錄因子AP-1、NF-κB熒光報道質粒分別轉染E1A陽性組和對照組細胞，在轉染12小時后分別加入刺激因素LPS、TNFα作用12小時后收集細胞檢測各組細胞的熒光素酶活性及細胞裂解液中蛋白濃度

6、，用蛋白濃度較正測定的熒光素酶活性值，得到校正熒光素酶活性值。3、根據(jù)大鼠ICAM-1基因上游調控序列設計 AP-1、NF-κB寡核苷酸探針，利用上述探針、競爭探針和大鼠肺泡上皮細胞核蛋白進行EMSA實驗，確定ICAM-1基因上游調控區(qū)域的功能元件與轉錄因子的結合活性。4、利用轉錄因子NF-кB抑制劑TPCK處理E1A陽性組和對照組細胞后，加入刺激因素LPS、TNFα作用24小時后收集細胞進行ICAM-1蛋白表達的測定，明確轉錄因子NF

7、-кB在：ICAM-1基因表達中的作用。 三、E1A蛋白對TNFα誘導下細胞凋亡的影響：用Hoechest熒光染色及PI、結合膜聯(lián)蛋白V-FITC雙染法觀察30pg．L<'-1>TNFα作用E1A陽性組細胞和對照組細胞8小時后細胞的凋亡情況。 四、腺病毒ElA蛋白對轉錄因子AP-1、NF-кB轉錄活性的影響及氧化/抗氧化失衡對其的影響：1、刺激因素LPS和TNFα作用E1A陽性組細胞和對照組細胞，分別于刺激因素作用前、作

8、用后30分鐘、1小時、4小時收集細胞核蛋白進行轉錄因子AP-1、NF-кB活化蛋白表達的免疫印記檢測，同時收集細胞總蛋白對轉錄因子NF-кB總蛋白表達進行免疫印記檢測。2、用抗氧化物質NAC以及GSH合成酶抑制劑BSO預處理E1A陽性組細胞及對照質粒轉染細胞后，再加入LPS和TNFα作用細胞4小時，收集細胞核蛋白進行轉錄因子NF-кB活化蛋白表達的免疫印記檢測。 五、腺病毒E1A蛋白對生理濃度的糖皮質激素抗炎作用的影響及其機制：

9、1、用生理濃度的糖皮質激素預處理CCL149細胞后在加入致炎因素LPS，ELISA法檢測炎性因子IL-6蛋白表達的影響；2、用生理濃度下糖皮質激素、HDAC抑制劑(TSA)預處理CCL149細胞后再加入LPS，ELISA法檢測細胞IL-6蛋白的表達；3、比色法檢測LPS、HDAC抑制劑以及生理濃度下糖皮質激素作用CCL149細胞后，細胞HDAC活性的變化；4、ELISA法檢測生理濃度的糖皮質激素對E1A組陽性細胞和對照組細胞在LPS誘導

10、下IL-6蛋白表達的影響；5、比色法檢測致炎因素LPS、HDAC抑制劑以及生理濃度下糖皮質激素對E1A陽性組細胞和對照細胞HDAC活性的影響。 結果: 一、成功克隆出E1A基因完全編碼區(qū)基因序列，構建含E1A基因完全編碼區(qū)的重組質粒pCDNA<,3>－E1A、，pEGFP-C<,2>－E1A。將重組質粒與對照質粒轉染CCL149細胞后經G418抗性篩選，E1A組共得到94個抗性細胞克隆，其中有9個細胞克隆經PCR檢測能擴

11、增出1 560 bp的基因片段，進一步RT-PCR檢測有4個細胞克隆能擴增出E1A基因486bp特異性片段，而對照質粒組細胞和正常大鼠肺泡上皮細胞均無特異性條帶顯示；4個RT-PCR陽性的細胞克隆行免疫組化結果顯示：E1A陽性的細胞克隆均在細胞核內出現(xiàn)棕黃色細胞染色，而對照質粒組細胞和正常大鼠肺泡上皮細胞均未見陽性染色；Western-Blot結果顯示：4個E1A陽性細胞克隆均出現(xiàn)大小約為45～48、50～52 kDa E1A特異性的蛋

12、白條帶，而對照質粒組與正常大鼠肺泡上皮細胞均未出現(xiàn)特異性蛋白條帶。因此穩(wěn)定表達E1A蛋白的大鼠肺泡上皮細胞株構建成功。通過細胞增殖曲線及流式細胞增殖周期的觀察發(fā)現(xiàn)：與對照細胞相比E1A組細胞增殖時間明顯延長；細胞周期分析發(fā)現(xiàn)：與對照質粒轉染細胞相比，E1A穩(wěn)定轉染細胞出現(xiàn)明顯的S期縮短、G<,1>期延長，細胞形態(tài)學變化表現(xiàn)為：細胞生長趨向為集簇狀，細胞核增大，細胞體積變小。 二、在刺激因素LPS、TNFα作用下，E1A陽性組與對

13、照質粒組在細胞因子IL-6、TNFα的mRNA、蛋白表達方面無明顯差別；而細胞因子ICAM-1 mRNA和蛋白表達在E1A組明顯高于對照組；轉錄因子熒光報道系統(tǒng)顯示：在刺激因素作用前后轉錄因子AP-1、NF-кB轉錄活性在E1A組均明顯高于對照組；進一步作轉錄因子AP-1、NF-кB在 ICAM-1基因上游調控序列功能元件結合活性的EMSA，結果顯示：與對照組相比，E1A組在刺激因素作用后NF-кB與ICAM-1基因上游調控元件結合活性

14、明顯增高；而AP-1與ICAM-1基因上游調控元件結合活性無明顯變化。NF-кB抑制劑TPCK能完全阻斷E1A上調ICAM-1蛋白表達的作用。因此，腺病毒E1A蛋白上調ICAM-1表達的機制主要是通過轉錄因子NF-кB實現(xiàn)的。 三、細胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)：在30pg．L<'-1>TNFα作用下，E1A陽性組凋亡細胞明顯增多，與對照相比差別有統(tǒng)計學意義。 四、免疫印記結果顯示：刺激因素LPS、TNFα作用后，E1A陽性組細胞轉錄

15、因子AP-1核轉錄活性與對照質粒組相比，差別無明顯顯著性；而轉錄因子NF-кB核轉錄活性在E1A陽性組明顯高于對照組；BSO處理細胞后能明顯增加E1A上調NF-кB核轉錄活性的作用；抗氧化劑NAC能明顯抑制E1A上調NF-кB核轉錄活性的作用；相對與對照質粒轉染組，E1A對NF-кB總蛋白表達無明顯影響。因此，腺病毒E1A蛋白在不影響NF-кB總蛋白表達的情況下能明顯上調轉錄因子NF-кB轉錄活性，腺病毒E1A蛋白能明顯降低細胞對氧化/

16、抗氧化失衡的耐受性，活化NF-кB轉錄活性的作用。 五、生理濃度的糖皮質激素能明顯抑制CCL149細胞在LPS誘導下IL-6蛋白的表達；HDAC抑制劑TSA能完全抑制糖皮質激素的抗炎作用。通過測定CCL149細胞HDAC活性顯示：刺激因素LPS能顯著降低細胞HDAC活性，而生理濃度的糖皮質激素能恢復細胞HDAC的活性。證實生理濃度糖皮質激素有一定抗炎作用，而這一作用的發(fā)揮重要是通過HDAC來實現(xiàn)的；進一步檢測E1A陽性組與對照質

17、粒組細胞HDAC活性，結果顯示：兩組在各處理因素作用下，細胞HDAC活性無顯著差別，E1A蛋白對生理濃度糖皮質激素抗炎作用無明顯影響。 結論: 1、腺病毒E1A蛋白能夠放大致炎因素誘導下炎癥因子ICAM-1 mRNA和蛋白水平的表達。E1A蛋白主要通過上調轉錄因子NF-кB的轉錄活性，增加NF-кB與ICAM-1基因上游調控元件的結合來增加ICAM-1基因的表達。 2、E1A蛋白能夠增加細胞對致凋亡因素的敏感性，