早產(chǎn)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)分化的研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：建立高氧細(xì)胞損傷模型，探討高氧對早產(chǎn)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AECⅡ)增殖和轉(zhuǎn)分化的影響，為高氧肺損傷時肺泡化障礙及肺損傷修復(fù)機(jī)制的研究提供實驗依據(jù)。
　　 方法：原代培養(yǎng)早產(chǎn)大鼠(孕19～20 d)AECⅡ，于接種15 h 貼壁并更換培養(yǎng)液后，隨機(jī)分為空氣組和高氧組。高氧組通入 95[％] O2-5[％] CO2 10 min 后置于370C、5[％]CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，空氣組直接置于370C、5[

2、％]CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)后24、48及72 h，收獲各組細(xì)胞。高氧對早產(chǎn)大鼠AECII轉(zhuǎn)分化的影響：利用倒置相差顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測AECⅡ特異性肺泡表面活性蛋白-C(SP-C)及肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞(AECⅠ)特異性蛋白水通道蛋白5(AQP5)的表達(dá)；RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測SP-C、AQP5 mRNA及蛋白的表達(dá)。高氧對早產(chǎn)大鼠AECII增殖的影響：利用血球計數(shù)板計數(shù)法對培養(yǎng)細(xì)胞計數(shù)；

3、臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；免疫熒光法檢測Ki67表達(dá)。
　　 結(jié)果：空氣組AECII在培養(yǎng)后其數(shù)目不斷增加，高氧組給氧后48和72 h，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞活力降低。高氧使G0/G1期細(xì)胞比例顯著增多，S和G2/M期細(xì)胞比例明顯減少。高氧組給氧后24、48及72 h，Ki67+細(xì)胞的表達(dá)率及熒光指數(shù)(FI)較相同時間點空氣組均明顯降低(P<0.05或 P<0.01)。同時，隨著給氧時間延長，原代培養(yǎng)的AEC

4、Ⅱ伸展變平，失去其板層體及微絨毛，喪失AECⅡ的特性，獲得AECⅠ樣外觀。伴隨其形態(tài)學(xué)改變，AECⅡ逐漸停止表達(dá)其特異性蛋白SP-C，開始表達(dá)AECⅠ特異性蛋白AQP5。高氧組給O2后24、48及72 h，SP-C mRNA、SP-C+細(xì)胞的表達(dá)率及熒光指數(shù)較同時間點空氣組明顯降低 (P<0.05或P<0.01)，AQP5的上述指標(biāo)在給O2后24 及48 h 則較空氣組明顯增加 (P<0.05或P<0.01)，給O2后72 h，AQP5

5、的表達(dá)開始減弱，與同時間點空氣組相比無明顯差異(P﹥0.05)。
　　 結(jié)論：(1)原代培養(yǎng)的早產(chǎn)大鼠AECⅡ暴露在高氧環(huán)境中發(fā)生G1期阻滯，Ki67表達(dá)減少，細(xì)胞增殖受抑，可能是高氧肺損傷肺泡化障礙發(fā)生的原因之一；(2)體外培養(yǎng)的AECⅡ可自然轉(zhuǎn)分化，但暴露在高氧環(huán)境中其轉(zhuǎn)分化明顯加速，高氧誘導(dǎo)早產(chǎn)大鼠AECⅡ轉(zhuǎn)分化在不成熟肺泡上皮細(xì)胞損傷修復(fù)中起重要作用。
　　 第二部分
　　 目的：建立早產(chǎn)大鼠肺泡Ⅱ型上皮

6、細(xì)胞(AECⅡ)與肺成纖維細(xì)胞(LF)共培養(yǎng)模型，觀察與LF共培養(yǎng)下早產(chǎn)大鼠AECⅡ增殖與轉(zhuǎn)分化的生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究AECⅡ與LF在肺發(fā)育及肺損傷中的相互作用提供實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：分離、純化并簽定早產(chǎn)大鼠AECⅡ和LF，利用PCF插入式Millicell培養(yǎng)皿和6孔板構(gòu)建AEC-LF共培養(yǎng)模型，AEC Ⅱ以5×105/mL的密度接種到6孔板中，LF以1×106/mL的密度接種到PCF插入式Millicell培養(yǎng)皿中，

7、以6孔板中不放入套皿單獨培養(yǎng)的AECⅡ為對照。于單獨培養(yǎng)和共培養(yǎng)后2 d和4 d，利用倒置相差顯微鏡觀察AECⅡ形態(tài)和基本生長情況；血球計數(shù)板計數(shù)各組不同時間點細(xì)胞數(shù)；臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力；RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測肺泡表面活性蛋白-C(SP-C)、水通道蛋白5(AQP5)mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及Ki67表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建出早產(chǎn)大鼠AECⅡ和LF共培養(yǎng)模型，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞活

8、力可。(2)AEC Ⅱ單獨培養(yǎng)4 d，細(xì)胞分散生長，胞核伸展體積變大，核仁減少，部分轉(zhuǎn)分化為AECⅠ樣細(xì)胞；與LF共培養(yǎng)4 d，細(xì)胞呈大的聚集樣生長，細(xì)胞體積無明顯增大，胞核仍呈圓形。與單獨培養(yǎng)組相比，AECII與LF 共培養(yǎng)2 d 及4 d，其SP-C mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，而AQP5 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)則明顯減少(P＜0.05或P＜0.01)。上述細(xì)胞形態(tài)學(xué)及免疫標(biāo)記物檢測結(jié)果提示，與LF共培養(yǎng)時，AECⅡ

9、能較好地保留其細(xì)胞形態(tài)，向AECⅠ轉(zhuǎn)分化減少。(3)共培養(yǎng)2 d與單獨培養(yǎng)2 d 相比，AECⅡ的活力和細(xì)胞數(shù)目無明顯差異。單獨培養(yǎng)4 d，盡管AECII數(shù)目較單獨培養(yǎng)2 d 仍有增加，但增加幅度不明顯，且細(xì)胞活力明顯下降，而共培養(yǎng)4 d，AECII數(shù)目較單獨培養(yǎng)4 d 有明顯增加，且(95.2±4.9)[％]的AECII臺盼藍(lán)仍拒染。與單獨培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)2 d 及4 d，G0/G1期細(xì)胞均明顯減少(P＜0.01)，而G2/M及S期

10、細(xì)胞均明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)，且表達(dá)Ki67+細(xì)胞的比率及熒光指數(shù)明顯增加(P＜0.01)，說明與LF共培養(yǎng)時可促進(jìn)AECII增殖。
　　 結(jié)論：體外構(gòu)建的早產(chǎn)大鼠AECⅡ與LF共培養(yǎng)模型，部分模擬了體內(nèi)微環(huán)境。AECⅡ和LF共培養(yǎng)有利于保持AECⅡ的增殖和分化功能，可用于體外研究肺發(fā)育和肺損傷時AECⅡ和LF的相互作用。
　　 第三部分
　　 目的：觀察早產(chǎn)大鼠生后肺組織肺表面活性蛋白C(SP-

11、C)和水通道蛋白5(AQP5)表達(dá)的動態(tài)變化及高氧的影響，探討SP-C及AQP5在肺發(fā)育及肺損傷中的作用，為高氧肺損傷發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 方法：剖宮術(shù)取出孕21 d (足月為22 d)SD早產(chǎn)鼠，生后12～24 h 內(nèi)隨機(jī)分為空氣組和高氧組。高氧組持續(xù)暴露于85[％] O2 中，空氣組置于同一室內(nèi)常壓空氣中。兩組分別于暴露后1、4、7、10和 14 d 時，提取肺組織，采用免疫組織化學(xué)法對肺組織SP-C和AQP5表達(dá)定

12、位，RT-PCR測定SP-C和AQP5 mRNA的表達(dá)，Western-blot 法檢測 SP-C和AQP5蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)早產(chǎn)大鼠生后不同時間肺組織均有SP-C表達(dá)，以生后1 d 表達(dá)最明顯，1 d 以后在正常肺發(fā)育時下降，其陽性染色信號主要定位于AECⅡ。與同時間點空氣組相比，高氧暴露1 d 時，肺組織SP-C mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，以后增加，高氧7 d 增加最明顯(p<0.01)，高氧1

13、4 d 時SP-C表達(dá)較空氣組又減弱(p<0.05)。(2)早產(chǎn)大鼠生后肺組織AQP5表達(dá)不斷增強，其陽性染色主要定位于AECⅠ。與同時間點空氣組相比，高氧暴露1 d 時，僅肺組織AQP5 mRNA表達(dá)顯著高于對照組(P＜0.05)，而高氧暴露4、7、10及14 d 時，其mRNA及蛋白表達(dá)均明顯減少(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 結(jié)論：SP-C和AQP5參與了早產(chǎn)大鼠肺發(fā)育及高氧肺損傷的生理與病理過程；高氧暴露導(dǎo)致AQ