葡萄糖再灌注誘導的人臍靜脈內皮細胞氧化損傷與線粒體功能障礙的關系.pdf

1、糖尿病是近年來嚴重危害人類健康的慢性代謝性疾病,其中糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病的主要致殘及致死因為。如何減少和延緩糖尿病患者血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展迫在眉睫?？刂蒲鞘翘悄虿≈委煹氖滓胧?但在降糖過程中,難以避免的低血糖會減少降糖益處,甚至可能增加死亡風險。近期大規(guī)模強化降糖研究結果提示,強化降糖與嚴重低血糖發(fā)生率增加密切相關；強化降糖不但沒有減少心血管疾病的發(fā)生率,反而增加了全因死亡率。因此,強化血糖控制引起的低血糖可能也是導致心血管疾

2、病風險增加的一個重要因素。
　　 既往研究顯示,低糖可以直接損傷神經細胞、胰島細胞和腫瘤細胞,其損傷機制與氧化應激有關。我科前期研究也提示低糖能夠誘導氧化應激而直接導致?lián)p傷了內皮細胞ECV304。因此,低血糖對機體的危害值得引起臨床醫(yī)生的高度重視。
　　 低血糖后及時給予葡萄糖是臨床醫(yī)生的積極對癥處理手段。但近年來國外有研究顯示,低糖后給予葡萄糖再灌注可以直接導致神經細胞氧化應激損傷,而且這種損傷作用明顯高于低糖本身。我

3、們將這種低糖后再補充葡萄糖導致的細胞或組織損傷稱為葡萄糖再灌注損傷(Glucose-reperfusion injury)。目前普遍認為血管性疾病的發(fā)生與內皮細胞的功能障礙有著密切的聯(lián)系。如前所述,低血糖可顯著增加糖尿病心血管事件的發(fā)生。而且我科既往研究已經提示低糖能夠誘導氧化應激水平升高而直接損傷內皮細胞ECV304。那么低糖后給予葡萄糖再灌注是否可誘導和(或)進一步加重內皮細胞功能損傷,從而導致血管性疾病發(fā)病風險增加,目前尚未見此類

4、報道。
　　 大量研究證實內皮細胞功能障礙與氧化應激相關。氧化應激的產物活性氧(ROS)主要包括超氧陰離子自由基(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(OH·)、一氧化氮(NO)等。ROS過多可直接引起細胞膜脂質過氧化反應、蛋白質變性膠連、DNA斷裂,引起內皮細胞損傷和功能障礙。ROS過多還可以導致低密度脂蛋白(LDL)被氧化修飾成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),ox-LDL對內皮細胞有細胞毒作用。
　　 線粒

5、體是細胞內活性氧的重要來源之一。電子經過線粒體呼吸鏈傳遞時,質子(H+)順濃度梯度回流至線粒體內膜的基質側,產生線粒體膜電位,以此儲存能量。線粒體跨膜電位對維持線粒體正常功能是必要的,是研究線粒體功能及其氧化應激損傷的一個重要指標。國外研究表明,氧化應激水平與線粒體膜電位水平呈正相關；使質子返流入基質能降低膜電位,導致線粒體ROS的形成大量減少。生理狀態(tài)下,大多數(shù)電子經過呼吸鏈傳遞并最終與氧和質子形成水；小部分電子從呼吸鏈的底物端漏出直

6、接還原氧分子形成超氧陰離子(O2-)。線粒體在正常生理狀態(tài)下產生少量的活性氧用于維護細胞的正常的生理功能。但在病理條件下,線粒體呼吸鏈電子傳遞阻力增大,致使電子發(fā)生泄漏而產生大量ROS,活性氧生成過多會引起細胞損傷。
　　 在正常情況下,過多的活性氧可被機體的抗氧化防御系統(tǒng)所清除；病理條件下體內的抗氧化酶活性明顯下降,抗氧化防御機制被攻潰,由此會加劇氧化應激對機體的損傷。超氧化物歧化酶(SOD)作為重要的抗氧化酶,能夠與超氧陰離

7、子相結合并與其發(fā)生歧化反應,使其變?yōu)闊o活性的產物。越來越多的研究結果表明,病理條件下SOD因發(fā)揮抗氧化作用而造成其活性下降。在真核生物中,位于線粒體內的MnSOD憑借其特殊的位置成為防護線粒體氧化損傷的第一道防線,因而研究MnSOD的活性變化具有重要意義。
　　 綜上所述,在高糖、低糖等條件下可誘導氧化應激水平升高從而介導內皮細胞損傷。那么葡萄糖再灌注是否同樣可導致內皮細胞氧化應激損傷呢?這種損傷作用和線粒體的關系如何呢?目前關

8、于這方面的研究未見報道。本課題以人臍靜脈內皮細胞株HUVEC-12細胞作為內皮細胞研究模型,觀察葡萄糖再灌注條件下HUVEC-12細胞內ROS產量和線粒體功能的改變,以期探索葡萄糖再灌注對內皮細胞的損傷作用及其可能機制,為保護內皮細胞的研究提供新的思路。
　　 第1章葡萄糖再灌注誘導氧化應激損傷對人臍靜脈內皮細胞功能的影響
　　 [目的]
　　 觀察葡萄糖再灌注條件HUVEC-12細胞內NO含量和ROS含量的變化

9、,初步探討葡萄糖再灌注對內皮細胞的損傷作用與氧化應激的關系。
　　 [研究對象和方法]
　　 1、以人臍靜脈內皮細胞株HUVEC-12細胞為研究對象,采用10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37.5℃,5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內。
　　 2、葡萄糖再灌注實驗分為7組:
　　 ①正常對照組(5.5mM組,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為5.5mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)
　　 ②持續(xù)無

10、糖組(0mM組,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)
　　 ③葡萄糖再灌注Ⅰ組(0-5.5 mM組,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,5.5mM葡萄糖再灌注15min)
　　 ④葡萄糖再灌注Ⅱ組(0-11.1 mM組,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,11.1mM葡萄糖再灌注15min)
　　 ⑤葡萄糖再灌注Ⅲ組(0-25 mM組

11、,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,25mM葡萄糖再灌注15min)
　　 ⑥持續(xù)高糖Ⅰ組(11.1mM組,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為11.1mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)
　　 ⑦持續(xù)高糖Ⅱ組(25mM組,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為25mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)
　　 以上各組正式干預前均采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時,以保持各組細胞同步化生長,各組均干預2小時15分鐘。

12、r>　　 3、細胞上清總一氧化氮(NO)含量檢測:采用硝酸酶還原法測定NO2-/NO3-水平,嚴格按照試劑盒的說明進行。
　　 4、細胞內ROS水平測定:HUVE-12細胞以每孔2×104種于十二孔板,采用超氧陰離子熒光探針Dihydroethidium(DHE)標記細胞,37℃孵育1h后用PBS緩沖液洗滌3次,立即用微孔板檢測系統(tǒng)(SpectraMax M5/M5e)在激發(fā)波535nm,發(fā)射波610nm測定細胞在不同濃度葡萄

13、糖干預后,在不同時間的細胞內熒光量的變化,間接反映ROS產量。
　　 5、統(tǒng)計學處理:各組數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)計量資料采用均數(shù)±標準差(x±s)表示,多組資料比較采用單向方差分析(One-wayANOVA)。若差異有顯著性,任意兩組間比較當滿足方差齊性時采用LSD法(Least-significant difference test)。,不滿足方差齊性要求時用Tamhane’s T2法進行檢驗。P<

14、0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 [結果]
　　 1、各組細胞NO含量:5.5mM組、0mM組、0—5.5mM組、0-11.1mM組、0-25mM組、11.1mM組、25mM組的NO含量分別是103.63±5.82、45.06±2.73、105.56±5.10、19.57±1.60、17.47±1.74、29.45±0.74、26.35±6.28。不同干預條件下各組間NO含量差異有統(tǒng)計學意義(F=277.305,

15、P=0.000)；與5.5mM組相比,0-11.1mM組、0-25mM組NO含量均顯著下降(P均<0.000)；且0-11.1mM組NO含量顯著低于0mM組和11.1mM組(P均<0.01)；0-25mM組NO含量顯著低于0mM組和25mM組(P均<0.05)。
　　 2、各組細胞ROS產量:5.5mM組、0mM組、0-5.5mM組、0-11.1 mM組、0-25mM組、11.1mM組、25mM組的ROS產量分別是0.56±0.

16、06、0.88±0.07、0.66±0.08、0.67±0.16、1.35±0.12、0.47±0.06、0.82±0.26。不同干預條件下各組間 ROS產量差異有統(tǒng)計學意義(F=13.993,P=0.000)；隨著葡萄糖再灌注濃度的升高,與0-5.5mM組和0-11.1mM組比較,0-25mM組ROS產量顯著增加(P均=0.000)；且0-25mM組ROS產量顯著高于0mM組、11.1mM組和25mM組(P均<0.01)。
　　

17、 [結論]
　　 1、葡萄糖再灌注導致細胞內NO含量顯著降低,提示葡萄糖再灌注可導致內皮細胞功能障礙。
　　 2、葡萄糖再灌注可誘導內皮細胞氧化應激水平升高。與持續(xù)低糖組和持續(xù)高糖組相比,葡萄糖再灌注組ROS產量升高更明顯。這一結果與葡萄糖再灌注導致的內皮細胞內NO含量變化呈負相關,提示葡萄糖再灌注可能通過誘導氧化應激介導內皮細胞功能障礙。
　　 第2章葡萄糖再灌注誘導人臍靜脈內皮細胞氧化應激的機制與線粒體功能

18、的關系
　　 [目的]
　　 觀察葡萄糖再灌注條件下HUVEC-12細胞ROS產量、線粒體膜電位(MMP)和線粒體超氧化物歧化酶(MnSOD)活性的變化,然后通過調節(jié)線粒體膜電位,觀察ROS含量和MnSOD活性的變化,初步探討線粒體功能改變對內皮細胞氧化應激的影響。
　　 [研究對象和方法]
　　 1、研究對象同第一章。
　　 2、實驗分組:將HUVEC-12細胞正常培養(yǎng)24小時后,換用無血清培養(yǎng)

19、基培養(yǎng)24小時(血清饑餓)保持細胞同步生長,待細胞至對數(shù)期后,開始用不同的完全培養(yǎng)基干預細胞,實驗分為兩部分:
　　 第一部分:
　　 ①正常對照組(5.5mM組,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為5.5mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)
　　 ②葡萄糖再灌注Ⅰ組(0-5.5mM組,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,5.5mM葡萄糖再灌注)
　　 ③葡萄糖再灌注Ⅱ組(0-11.1mM組

20、,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,11.1mM葡萄糖再灌注)
　　 ④葡萄糖再灌注Ⅲ組(0-25mM組,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,25mM葡萄糖再灌注)
　　 每組均于再灌注后的5min,10min,15min時間點檢測ROS產量和MMP水平；同時在再灌注后15min檢測MnSOD活性。
　　 第二部分:
　　 ①正常對照組(5.5mM

21、組,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為5.5mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中)
　　 ②葡萄糖再灌注A組(0-25mM組,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,25mM葡萄糖再灌注)
　　 ③葡萄糖再灌注B組(0-25mM+CCCP組,細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為0mM的RPMI1640完全培養(yǎng)基中2h,25mM葡萄糖再灌注+解耦聯(lián)劑CCCP0.05μM)
　　 每組各組均干預2小時15分鐘,于再灌注后

22、的15min檢測ROS產量、MMP水平和MnSOD活性。
　　 3、細胞內ROS產量測定同第一章。
　　 4、線粒體膜電位(MMP)測定:采用熒光探針Rhodamine123測定法檢測方法嚴格按試劑盒說明書要求進行。細胞接種于12孔板,調整細胞個數(shù)為2×104。經過干預處理后,移除培養(yǎng)基,加入含有1％熒光探針基礎培養(yǎng)液,置于325℃,5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育1h,PBS洗三遍,在激發(fā)波長為508 nm,發(fā)射波長529

23、nm條件下,用微孔板檢測系統(tǒng)(SpectraMax M5/M5e)檢測各樣本平均熒光強度(MFI)。
　　 5、線粒體超氧化物歧化酶(MnSOD)活性檢測:采用黃嘌呤氧化酶檢測法,嚴格按照試劑盒的說明進行。
　　 6、統(tǒng)計學處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示,2小時15分鐘內的ROS產量和MMP水平采用連續(xù)性重復測量的方差分析,并考慮交互效應及主效應影響；若交互效應顯著,則進

24、一步兩兩比較分析。多組資料比較采用單向方差分析(One-way ANOVA),進一步多重比較采用LSD法。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 [結果]
　　 1、0-25mM組與5.5mM組、0-5.5mM組、0-11.1mM組相比,ROS產量和MMP水平升高顯著(P均<0.000),且隨著再灌注時間的延長,ROS產量和MMP水平逐漸升高,15min升至最高水平。而0-25mM+CCCP組與0-25mM組相比,

25、ROS產量和MMP水平分別下降17％(P<0.05)、45％(P=0.001)。
　　 2、MnSOD活性的變化:與5.5mM組相比,0-5.5mM組、0-11.1mM組、0-25mM組的MnSOD活性分別下降11％、12％、25％(P均<0.05),且0-25mM組與0-5.5mM組、0-11.1mM組相比,MnSOD活性下降顯著(P均<0.01):而0-25mM+CCCP組與0-25mM組相比,MnSOD活性顯著升高23％(

26、P<0.01)。
　　 [結論]
　　 1、葡萄糖再灌注可導致線粒體膜電位水平明顯升高。
　　 2、葡萄糖再灌注條件下,線粒體膜電位水平與該條件下誘導產生的ROS含量呈正相關。提示:葡萄糖再灌注可能通過影響線粒體膜電位誘導內皮細胞內ROS生成增多。
　　 3、葡萄糖再灌注可導致MnSOD活性明顯下降。
　　 4、通過調節(jié)MMP的水平,葡萄糖再灌注組ROS產量和MnSOD活性均有顯著下降。提示:線粒