嗜熱四膜蟲(chóng)中染色體濃縮調(diào)節(jié)因子RCC1的鑒定及功能分析.pdf

1、Ran(Ras-like nuclear protein)是一種在真核生物中高度保守的小分子GTPase蛋白,屬于小G蛋白家族。Ran蛋白與不同的調(diào)節(jié)因子和輔助因子相互作用,參與核膜重建、紡錘體的組裝、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)和核質(zhì)間物質(zhì)的運(yùn)輸?shù)取an蛋白在其輔助蛋白的調(diào)控下進(jìn)行RanGTP和RanGDP兩種結(jié)合態(tài)之間不斷循環(huán)轉(zhuǎn)變,表現(xiàn)出功能的多樣性。
　　染色體濃縮調(diào)節(jié)因子RCC1(regulator of chromoso

2、me condensation1)是唯一已知的Ran的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子,含有保守的RLD(RCC1-like domain)結(jié)構(gòu)域,與Ran蛋白結(jié)合,促進(jìn)Ran-GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镽anGTP結(jié)合態(tài),從而促進(jìn)核質(zhì)運(yùn)輸,同時(shí)在染色體端粒沉默、細(xì)胞周期的調(diào)控和微管的組裝發(fā)揮重要功能。
　　嗜熱四膜蟲(chóng)(Tetrahymena thermophila)是一種營(yíng)自由生活的淡水單細(xì)胞原生生物,具有核的二態(tài)性,即含有多倍體的體細(xì)胞大核和二倍體生殖

3、小核。生殖方式主要有無(wú)性生殖和有性生殖兩種方式。無(wú)性生殖時(shí)期,大核無(wú)絲分裂而小核進(jìn)行有絲分裂;有性生殖時(shí)期,小核進(jìn)行減數(shù)分裂和有絲分裂后進(jìn)行核的交換進(jìn)而形成合子核,產(chǎn)生新的大核和小核而舊大核降解。嗜熱四膜蟲(chóng)細(xì)胞中核結(jié)構(gòu)精細(xì)動(dòng)態(tài)的變化使其成為研究細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和發(fā)育的良好模式生物。本課題組先前研究表明嗜熱四膜蟲(chóng)中 Ran和 RanBP1蛋白調(diào)控了大核的無(wú)絲分裂,它們的異常表達(dá)會(huì)使細(xì)胞增殖速度變慢,但至今還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)關(guān)于嗜熱四膜蟲(chóng)中RCC1蛋白的

4、相關(guān)研究。
　　本研究首次從嗜熱四膜蟲(chóng)大核基因組中鑒定出一個(gè)新的 RCC1基因,并在生物信息學(xué)水平和細(xì)胞分子水平進(jìn)行了分析,研究結(jié)果如下:
　　1.生物信息學(xué)分析通過(guò)同源序列比對(duì),我們從四膜蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ciliate.org)鑒定了人的 RCC1同源物 TTHERM_00530380基因,該基因全長(zhǎng)2541 bp,開(kāi)放閱讀框2181 bp,預(yù)測(cè)編碼726個(gè)氨基酸。對(duì)其氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)RCC1含有一

5、個(gè)RLD結(jié)構(gòu)域,將其編碼基因命名為四膜蟲(chóng)RCC1。Real-time PCR檢測(cè)RCC1的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)RCC1在嗜熱四膜蟲(chóng)不同細(xì)胞周期中都有表達(dá),并在有性生殖時(shí)期表達(dá)水平達(dá)到最高。本研究結(jié)果與四膜蟲(chóng)功能基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tfgd.ihb.ac.cn)中該基因的microarray表達(dá)譜相一致,進(jìn)一步證實(shí)了RCC1在四膜蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。聚類(lèi)分析表明 RCC1分子進(jìn)化和物種進(jìn)化相一致,表明了在生物進(jìn)化過(guò)程中,RCC1蛋白

6、具有保守的功能。
　　2. HA-RCC1的細(xì)胞定位構(gòu)建含有 HA標(biāo)簽的重組質(zhì)粒 pXS75-RCC1,將pXS75-RCC1轉(zhuǎn)入野生型的B2086和Cu428四膜蟲(chóng)細(xì)胞中,通過(guò)同源重組RCC1基因替代MTT1基因,RCC1在Cd2+誘導(dǎo)下受到MTT1基因啟動(dòng)子的調(diào)控,梯度增加巴龍霉素濃度篩選突變體細(xì)胞株,通過(guò)PCR鑒定獲得整合HA-RCC1基因的突變體細(xì)胞株。HA單克隆抗體免疫熒光定位分析表明,在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期,HA-RCC1特異地

7、定位于大核和小核,饑餓時(shí)期同樣定位于大核和小核中,在有性生殖時(shí)期,親本大核和小核仍有定位。此外 RCC1還定位于降解的舊大核上,直到親本大核完全降解,表明RCC1是細(xì)胞核特異的功能因子。
　　3. RCC1的過(guò)表達(dá)影響細(xì)胞核分裂在MTT1啟動(dòng)子調(diào)控下的HA-RCC1基因,通過(guò)不同濃度的Cd2+誘導(dǎo),實(shí)現(xiàn)HA-RCC1基因的過(guò)表達(dá)。通過(guò)DAPI染料對(duì)過(guò)表達(dá)RCC1的細(xì)胞株中的細(xì)胞核進(jìn)行染色,觀察細(xì)胞核分裂的過(guò)程。分析過(guò)表達(dá)HA-RC

8、C1對(duì)細(xì)胞發(fā)育的影響,結(jié)果顯示 RCC1過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞中大核無(wú)絲分裂異常,進(jìn)而抑制了大核的無(wú)絲分裂,最終產(chǎn)生部分無(wú)大核的異常細(xì)胞。
　　4. RCC1的敲減引起小核異常分裂為了進(jìn)一步分析RCC1的功能,構(gòu)建了RCC1基因敲除質(zhì)粒pNeo4-RCC1,pNeo4-RCC1轉(zhuǎn)化野生型四膜蟲(chóng)細(xì)胞,通過(guò)巴龍霉素濃度梯度篩選,細(xì)胞表型分配獲得 RCC1基因敲減突變體細(xì)胞株。結(jié)果表明 RCC1基因?qū)蟠陌l(fā)育是必須的。進(jìn)一步分析RCC1敲減

9、對(duì)細(xì)胞發(fā)育的影響,DAPI染色敲減 RCC1細(xì)胞株,觀察細(xì)胞核分裂的過(guò)程,發(fā)現(xiàn)發(fā)育的細(xì)胞中產(chǎn)生多個(gè)小核,大核無(wú)絲分裂受到抑制,而且抑制了細(xì)胞增殖速率。
　　總之,本研究首次從嗜熱四膜蟲(chóng)中鑒定出一個(gè)新的RCC1基因,RCC1的異常表達(dá)影響了細(xì)胞正常的核分裂,這種異常表型與Ran1的突變體GTP鎖定態(tài)和GDP鎖定態(tài)、異常表達(dá)RanBP1的表型是一樣的,暗示RCC1可能通過(guò)改變Ran-GTP的濃度梯度,進(jìn)而影響細(xì)胞的核發(fā)育。RCC1的正