錯配修復蛋白Mlh3在嗜熱四膜蟲有性生殖中的功能分析.pdf

1、DNA錯配修復（MMR）是進化上保守的機制，它能夠去除DNA復制或者損傷過程中引起的突變，矯正復制過程中產生的錯配堿基，從而維持基因組復制的準確性。在大腸桿菌細胞中，MMR系統(tǒng)包括 MutS， MutL，MutH等。酵母和哺乳類的MMR系統(tǒng)中有6個MutS同源物(MSH1，MSH2，MSH3，MSH4， MSH5，MSH6)，4個MutL的同源物( PMS1，MLH1， MLH3，酵母MLH2/哺乳類PMS2)。在E.coli中，MMR

2、蛋白MutS以同源二聚物的形式發(fā)揮功能，它的作用是識別發(fā)生錯誤配對的核苷酸鏈。在 ATP的水解作用下， MutS二聚物結合到 DNA鏈上，形成滑動夾，在 DNA鏈上滑動并募集另一種修復蛋白 MutL，進而將 MutH招募到錯配位點附近，并激活其核酸酶活性，在錯配位點附近切斷錯配堿基所在的DNA鏈。真核生物 MutL同源物有三種，其組成分別為 MutLα(MLH1/ PMS2)、MutLβ(MLH1/MLH1)和MutLγ(MLH1/ML

3、H3)。MutL是DNA修復系統(tǒng)中的關鍵組分，它的缺失瓦解了MMR系統(tǒng)，使DNA不能正常修復，大大增加了編碼基因的錯義突變和移碼突變頻率。MutLγ具有核酸內切酶的活性，減數(shù)分裂聯(lián)會階段，參與非姊妹染色單體之間的重組和交換過程。小鼠MLH3基因的缺失會導致不孕不育。
　　嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)在饑餓條件下，啟動有性生殖。小核進行減數(shù)分裂，三個減數(shù)分裂產物降解，第四個進行合子前的有絲分裂。配對細

4、胞交換配子核，當四膜蟲各自的一個配子核移動到與它配對的四膜蟲中，與相應未移動的配子核發(fā)生融合，受精發(fā)生。合子核經歷2次合子后的核分裂產生四個核，其中兩個發(fā)育成新的大核（大核原基），另外兩個發(fā)育成新小核。經過染色體程序化斷裂、DNA刪除和基因組復制等過程，新大核原基形成新的多倍體大核。在減數(shù)分裂時期，減數(shù)分裂特異的核酸酶 Spo11引起雙鏈DNA斷裂，小核拉伸進行同源染色體配對，錯配修復蛋白 MutS（Msh4和 Msh5）促進同源染色體

5、交叉的形成，解離酶 Mus81和解旋酶Sgs1促使同源染色體分離。MLH1的敲除并未引起小核減數(shù)分裂可見的異常。MutLγ在小核減數(shù)分裂染色體修復、新大核基因組重排修復中的作用并不清楚。
　　本研究首次從嗜熱四膜蟲中鑒定出有性生殖特異表達的錯配修復基因 MLH3，并對其在四膜蟲有性生殖發(fā)育中的功能做了系統(tǒng)分析，獲得以下結果：
　　1．MLH3基因的鑒定與分析
　　本研究通過cDNA末端快速擴增法，獲得長度1189 bp

6、的cDNA，開放閱讀框為960 bp，5′UTR距離ATG為18 bp，3′UTR為211 bp， polyA尾長為48 bp，預測編碼319個氨基酸。Blast分析表明（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）Mlh3含有進化上保守的具有內切核酸酶活性的Mn離子結合位點DQHA(X)2E(X)4E。Microarray表達譜表明MLH3是有性生殖期特異表達基因(http://tfgd.ihb.a

7、c.cn)。
　　2．Mlh3定位在生殖核和新發(fā)育的大核
　　為了分析Mlh3在四膜蟲中的定位，本研究首先構建了帶有HA標簽的重組質粒pXS75-MLH3和帶有紅色熒光蛋白mCherry標記的重組質粒，轉化入四膜蟲，經巴龍霉素（PM）濃度梯度的篩選，獲得 HA-MLH3和 mCherry-MLH3重組細胞株。間接免疫熒光定位顯示 HA-Mlh3在有性生殖早期定位于小核中，在Anlagen時期定位于新發(fā)育的大核中，在發(fā)育的晚期

8、，定位消失?；罴毎ㄎ伙@示HA-Mlh3有性生殖中定位于小核。結果表明Mlh3可能參與了小核和新大核的發(fā)育進程。
　　3．敲除MLH3影響有性生殖核發(fā)育進程
　　為了分析MLH3的功能，構建并獲得MLH3完全敲除的突變細胞株。在有性生殖發(fā)育早期，MLH3敲除突變體細胞并沒有明顯發(fā)育異常；在發(fā)育后期，當55％的野生型細胞發(fā)育成兩大核一小核的單細胞狀態(tài)時，MLH3敲除突變細胞中，20%保留在配對的大核原基階段，45%在兩大核兩小

9、核階段，并未出現(xiàn)1個小核和2個大核狀態(tài)的單細胞；48 h時，70%野生型細胞發(fā)育到兩大核一小核階段，而MLH3敲除突變配對細胞消失，僅保留1個生殖核和1個營養(yǎng)核的沒有配對的單細胞。
　　4．敲除MLH3影響新大核基因組復制和修復
　　MLH3敲除細胞有性生殖后期發(fā)育異常。為了分析可能的原因，分析了發(fā)育中大核基因組的斷裂修復和內部復制。γ-H2AX免疫熒光定位表明，在新大核發(fā)育時期，MLH3敲除突變體細胞除了在新發(fā)育的大核存在

10、斷裂信號，在小核中也檢測到定位信號。推測小核基因組中存在未被修復的斷裂片段。在發(fā)育到后期，MLH3敲除突變細胞的新大核和新小核中熒光定位信號并未消失，表明DNA斷裂仍未修復。5．MLH3敲除導致有性生殖后代不能存活
　　為了進一步證實 MLH3敲除影響了后代發(fā)育，進行了后代存活率檢測。結果發(fā)現(xiàn)，敲除 MLH3之后，接合生殖產物并不是真正的后代。流式細胞檢測表明，正常細胞有性生殖發(fā)育成兩大核一小核階段，MLH3敲除細胞卻出現(xiàn)凋亡跡象

11、。
　　本課題首次從嗜熱四膜蟲中鑒定出一種錯配修復基因MLH3，構建并獲得了它的過表達細胞株和敲除突變穩(wěn)定株。HA標簽固定細胞定位和mCherry標簽活細胞定位顯示：在接合生殖前期，Mlh3特異性的定位在小核中，在大核發(fā)育時期，新大核上也有Mlh3的定位。MLH3敲除之后，四膜蟲接合生殖進程受到影響，并且不能產生真正的可育后代，在接合生殖后期，新發(fā)育的大核和小核存在DNA斷裂損傷，并且不能修復，細胞發(fā)生裂解。由此可見，在接合生殖過