嗜熱四膜蟲中Chromodomain蛋白Tcd3和Tcd4的表達(dá)調(diào)控與功能分析.pdf

1、Chromodomain(chromatin organization modifier domain)是一個(gè)由30～50個(gè)氨基酸組成的保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，含有Chromodomain的蛋白質(zhì)廣泛存在于多種生物中的染色質(zhì)結(jié)合蛋白中，通過與組蛋白或RNA的作用參與了異染色質(zhì)的形成及基因的表達(dá)調(diào)控。
　　四膜蟲中程序性全基因組重排在有性生殖過程中發(fā)生，siRNA，MeH3K9，Pdd1p和Pdd3p參與這一過程，然而其詳細(xì)機(jī)制仍不清楚

2、。本研究從四膜蟲基因組中篩選到兩個(gè)含有Chromodomain的基因TCD3(Tetrahymena Chromo Domain3)與TCD4(Tetrahymena Chromo Domain4)，對(duì)這兩個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞定位進(jìn)行了研究，獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.TCD3和TCD4序列分析通過生物信息學(xué)的方法，從四膜蟲大核基因數(shù)據(jù)庫鑒定了TCD3（TTHERM_00585180）和TCD4(TTHERM_00585190

3、)，兩個(gè)基因串聯(lián)于同一條大核染色體上，間隔237bp，兩個(gè)基因內(nèi)均具有GT-AG的內(nèi)含子。TCD3和TCD4基因擬編碼的蛋白334個(gè)和344個(gè)氨基酸殘基組成，分子量分別為40.26kDa和41.11kDa，等電點(diǎn)(pI)分別為4.590和5.435。全基因表達(dá)Microarray分析表明TCD3和TCD4在四膜蟲營養(yǎng)生殖階段和饑餓期不表達(dá)，在有性生殖過程中8h時(shí)表達(dá)量最高，并且兩者的表達(dá)譜一致。
　　2.TCD3和TCD4的5'和

4、3'-RACETCD3和TCD4的ORF分別為1005bp和1035bp，大核染色體中基因全長分別為1241bp和1429bp，各含有兩個(gè)內(nèi)含子。5'RACE和3'RACE表明TCD3和TCD4的5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)長度分別為40bp和43bp，3'端非編碼區(qū)(3'-UTR)長度分別為90bp和189bp。Chromodomain聚類分析表明Tcd3和Tcd4與pdd1p蛋白的Chromodomain最為相似，SWISS—MO

5、DEL預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Tcd4的Chromodomain缺失α-螺旋結(jié)構(gòu)。
　　3.Tcd3和Tcd4的免疫熒光定位構(gòu)建含有HA標(biāo)簽的表達(dá)載體OE-PBX-TCD3和OE-PBX-TCD4,轉(zhuǎn)化四膜蟲CU428和B2086細(xì)胞株，通過巴龍霉素篩選，PCR鑒定，獲得HA-Tcd3和HA-Tcd4的過表達(dá)細(xì)胞株。激光共聚焦顯微鏡對(duì)HA-Tcd3和HA-Tcd4的免疫熒光定位發(fā)現(xiàn):HA-Tcd3定位于四膜蟲有性生殖核發(fā)育的親本大核和新發(fā)育的大核

6、中;HA-Tcd4則定位于conjusome和新發(fā)育的大核中。
　　TCD3和TCD4相似的序列特征，保守的Chromodomain位置，一致的表達(dá)譜，表明兩個(gè)基因中的一個(gè)很可能源于基因復(fù)制，進(jìn)而加強(qiáng)該基因的功能。TCD3和TCD4在四膜蟲接合生殖時(shí)期特異表達(dá)，都能夠定位于新的發(fā)育的大核中，表明Tcd3和Tcd4極有可能參與了新的大核發(fā)育過程中程序性基因組重排。Tcd3和Tcd4在親本大核和conjusome特異的定位，以及不同的