含熒光素酶嗜熱四膜蟲的構(gòu)建及對(duì)重金屬離子的響應(yīng).pdf

1、金屬硫蛋白(Metallothioneins，MTs)廣泛存在于各種生物體中，是一類富含半胱氨酸可被鎘、銅、鋅、鉛或汞等金屬誘導(dǎo)表達(dá)的低分子量蛋白，同時(shí)可作為生物標(biāo)記物用于環(huán)境中重金屬污染的監(jiān)測(cè)。根據(jù)來源，金屬硫蛋白被分為15個(gè)家族，其中四膜蟲金屬硫蛋白屬于第7家族。
　　 嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)是一類纖毛類原生動(dòng)物。在嗜熱四膜蟲中存在五種金屬硫蛋白基因，分別為:MTT1，MTT2，MTT3

2、，MTT4和MTT5，根據(jù)對(duì)鎘或銅的不同誘導(dǎo)表達(dá)響應(yīng)模式等特征，四膜蟲MTs被進(jìn)一步劃分為7a(CdMTs)和7b(CuMTs)兩個(gè)亞家族。為了獲得可用于快速檢測(cè)環(huán)境中重金屬污染的全細(xì)胞生物傳感器(Whole cell biosensor，WCB)，我們將MTT1基因啟動(dòng)子分別與作為報(bào)告元件的螢火蟲熒光素酶基因(Firefly Luciferase，F(xiàn)luc)和海腎熒光素酶基因（RenillaLuciferase，Rluc）重組，構(gòu)建嗜

3、熱四膜蟲細(xì)胞全細(xì)胞生物傳感器;此外，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)五種四膜蟲MTs的轉(zhuǎn)錄情況，對(duì)四膜蟲MTs的轉(zhuǎn)錄機(jī)制進(jìn)行了初步研究，獲得結(jié)果如下:
　　 1.Fluc和Rluc基因的優(yōu)化Fluc基因全長(zhǎng)1653bp，編碼551個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為61kDa;而Rluc基因全長(zhǎng)936bp，編碼311個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為36kDa。通過PCR技術(shù)將Fluc基因的終止密碼子TAA(在四膜蟲中編碼Gln

4、)優(yōu)化為四膜蟲中的終止密碼子TGA;通過人工合成技術(shù)將Rluc基因全序列優(yōu)化為四膜蟲的偏愛密碼子。從而獲得兩種可在四膜蟲體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的熒光素酶基因。
　　 2.含有熒光素酶的四膜蟲全細(xì)胞生物傳感器的構(gòu)建構(gòu)建重組質(zhì)粒pBX-Fluc和pBX-Rluc，其中含有熒光素酶基因，MTT1基因啟動(dòng)子，HA標(biāo)簽，neo2抗性基因;通過基因槍粒子轟擊法將pBX-Fluc和pBX-Rluc質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入嗜熱四膜蟲細(xì)胞中，通過同源重組和巴龍霉素抗

5、性篩選，F(xiàn)luc和Rluc基因整合到四膜蟲大核基因組MTT1位點(diǎn)，獲得含有熒光素酶基因的重組四膜蟲細(xì)胞株B2086-Fluc和CU428-Rluc。
　　 3.重組四膜蟲對(duì)重金屬離子的監(jiān)測(cè)在重金屬離子誘導(dǎo)時(shí)B2086-Fluc和CU428-Rluc表達(dá)產(chǎn)生熒光素酶，催化熒光素氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物熒光，通過熒光測(cè)定儀測(cè)定氧化過程中釋放的生物熒光，進(jìn)而通過直觀的數(shù)據(jù)來反應(yīng)四膜蟲WCBs響應(yīng)重金屬離子的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)B2086-Fluc對(duì)

6、重金屬鎘和汞的響應(yīng)最敏感，可檢測(cè)的最低濃度為5～10 ng/mL;對(duì)銅和鋅的響應(yīng)較弱，可檢測(cè)的最低濃度為0.5～1 mg/mL;CU428-Rluc也對(duì)重金屬鎘和汞的響應(yīng)最敏感,可檢測(cè)的最低濃度為5 ng/mL;對(duì)銅和鋅的響應(yīng)較弱，可檢測(cè)的最低濃度為0.1mg/mL; Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)全序列優(yōu)化后的Rluc在重金屬離子誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)量比Fluc高，且重組四膜蟲CU428-Rluc響應(yīng)重金屬的范圍更廣。
　　 4嗜熱

7、四膜蟲CdMTs和CuMTs對(duì)Cr(Ⅵ)的不同響應(yīng)Cr(Ⅵ)對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞繁殖速度影響的半致死量為80μM，而Cr(Ⅲ)的半致死量為3mM。通過qRT-PCR方法檢測(cè)Cr(Ⅵ)單獨(dú)誘導(dǎo)和Cr(Ⅵ)與Cd(Ⅱ)/Cu(Ⅱ)雙重誘導(dǎo)時(shí)CdMTs和CuMTs的表達(dá)情況，結(jié)果表明Cr(Ⅵ)單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí)促進(jìn)CuMTs的表達(dá)，而對(duì)CdMTs的表達(dá)影響不明顯;Cr(Ⅵ)抑制Cd(Ⅱ)/Cu(Ⅱ)誘導(dǎo)的CdMTs的高表達(dá)，而對(duì)Cd(Ⅱ)/Cu(Ⅱ)誘導(dǎo)