含有HMg-box的HmgB3在嗜熱四膜蟲細(xì)胞中的功能分析.pdf

1、高遷移率族蛋白（high mobility group protein，HMG）是一系列的染色體非組蛋白，普遍存在于真核細(xì)胞中。根據(jù)HMG蛋白不同序列的相似性以及與DNA結(jié)合的特性可將經(jīng)典的HMG蛋白分為三類:HMGA，含有AT-hook結(jié)構(gòu)域;HMGB，含有HMG-box結(jié)構(gòu)域;HMGN，含有獨(dú)特的核小體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。HMG-box高度保守，含有一個(gè)特征性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即可由大約80個(gè)氨基酸形成3段α螺旋成“L”型折疊，其可插入到

2、DNA小溝處并與DNA小溝相結(jié)合。包含有HMG-box的HMGB蛋白在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，如參與DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，修復(fù)，重組，細(xì)胞的分化，凋亡等。嗜熱四膜蟲（Tetrahymena thermophila）是一種單細(xì)胞的原生動(dòng)物，具有核二態(tài)性，即一個(gè)二倍體的生殖小核和一個(gè)多倍體的體細(xì)胞大核。在四膜蟲內(nèi)，兩種不同的HMGB家族蛋白HMG B和HMG C已經(jīng)被研究，HMG C只定位于大核，HMG B在大核和小核中都存在，并且HMG B

3、可能參與DNA復(fù)制。
　　本研究從四膜蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了一種新的包含有HMG-box的基因HMGB3，對(duì)其結(jié)構(gòu)及其定位進(jìn)行了分析，獲得的主要結(jié)果如下：⑴HMGB3的生物信息學(xué)分析HMGB3(TTHERM_00155590)擬編碼670個(gè)氨基酸，在其N端含有一個(gè)HMG-box結(jié)構(gòu)域，中間區(qū)域富含堿性的絲氨酸賴氨酸，C端則是一個(gè)中性的結(jié)構(gòu)域，磷酸化分析表明C端結(jié)構(gòu)域的S598，S602，S603，S612，S614，S615和S6

4、167個(gè)位點(diǎn)可能被磷酸化從而形成一個(gè)酸性的C端結(jié)構(gòu)域。RT-PCR結(jié)果表明HmgB3在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期只有很低的表達(dá)，在接合時(shí)期上調(diào)并在2～4 h達(dá)到最高值，這與Microarray分析的結(jié)果相一致。⑵HmgB3在細(xì)胞內(nèi)的定位構(gòu)建含有HA-tag的表達(dá)載體pBX-HA-HMGB3，并將其成功轉(zhuǎn)化四膜蟲細(xì)胞CU428和B2086，通過(guò)逐級(jí)增加巴龍霉素的濃度經(jīng)過(guò)PCR鑒定獲得穩(wěn)定的陽(yáng)性細(xì)胞株。通過(guò)對(duì)HA-HmgB3免疫定位發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)生殖時(shí)期，

5、HmgB3特異地定位于小核上。在饑餓時(shí)期，HmgB3則定位于小核的外周。在接合時(shí)期，HmgB3則特異地定位于有絲分裂和減數(shù)分裂的功能小核上，而在降解的小核中沒(méi)有定位。過(guò)表達(dá)的HmgB3異常定位于新形成的大核上，進(jìn)而導(dǎo)致有性生殖產(chǎn)生的子代的存活率僅達(dá)正常的50％左右。⑶截短型HmgB3在細(xì)胞內(nèi)的定位為了研究HmgB3特異地定位機(jī)制，我們構(gòu)建了不同的HmgB3的截短型表達(dá)載體以了解HmgB3的不同結(jié)構(gòu)域在HmgB3定位中所起的作用。通過(guò)免疫