嗜熱四膜蟲(chóng)小核特異組蛋白Mlh1的定位和功能分析.pdf

1、在真核細(xì)胞中，染色質(zhì)是由DNA，組蛋白，非組蛋白以及少量的RNA組成的。染色質(zhì)的基本單位是核小體。核小體是由146 bp的左手超螺旋DNA纏繞著組蛋白八聚體組成的。組蛋白八聚體是由進(jìn)化上比較保守的核心組蛋白H2A，H2B，H3， H4各兩個(gè)單體構(gòu)成。連接組蛋白則可以將DNA鎖定在核小體上。在不同生物中，連接組蛋白在進(jìn)化上不保守，在維持基因組的穩(wěn)定性，特定基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，染色質(zhì)重塑，以及DNA損傷修復(fù)等方面發(fā)揮著重要的作用。
　　嗜

2、熱四膜蟲(chóng)（Tetrahymean thermophila）具有傳統(tǒng)纖毛蟲(chóng)特異的大核和小核的細(xì)胞雙核體系。大核和小核中具有結(jié)構(gòu)不同的組蛋白H1。小核特異組蛋白MLH1（micronuclear linker histone）在生長(zhǎng)期表達(dá)量低，而在有性生殖時(shí)期表達(dá)水平顯著提高，然而其具體的生物學(xué)功能并不清楚。本研究對(duì)Mlh1在四膜蟲(chóng)中的功能進(jìn)行了系統(tǒng)分析研究，獲得主要結(jié)果如下：
　　1. MLH1基因的生物信息學(xué)分析 MLH1（TTH

3、ERM_00471820）在四膜蟲(chóng)大核基因組中無(wú)內(nèi)含子序列，開(kāi)放閱讀框1902 bp，編碼633個(gè)氨基酸。含有21.5％的賴氨酸和23.1%的絲氨酸。序列中含有一個(gè)較為保守的HMG-box結(jié)構(gòu)域（93-158aa），該結(jié)構(gòu)域?qū)儆?II/III類的 HMG-box超家族。與四膜蟲(chóng)高遷移率族蛋白 HmgB3（TTHERM_00155590）的HMG-box有35%的一致性。MLH1在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和饑餓前期有較低的表達(dá)，饑餓后期幾乎不表達(dá)，而在

4、有性生殖時(shí)期表達(dá)水平顯著提高，有性生殖時(shí)期6h達(dá)到最高。
　　2. Mlh1在不同發(fā)育階段的定位 Mlh1在生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期會(huì)水解成不同的片段α，β，γ，δ。分別構(gòu)建了含HA-tag和Flag-tag的pXS75-MLH1、pXS75-MLH1-α、pXS75-MLH1-β、pXS75-MLH1-γ、 pXS75-MLH1-δ載體，轉(zhuǎn)化嗜熱四膜蟲(chóng)細(xì)胞中，利用巴龍霉素抗性篩選出突變株。免疫熒光定位分析表明，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期 HA-Ml

5、h1定位在小核上，而HA-α，HA-β，HA-γ，HA-δ定位在胞質(zhì)中，表明全長(zhǎng)Mlh1對(duì)于小核連接組蛋白的入核是必須的。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期HA-Mlh1定位在小核上，而Mlh1-Flag沒(méi)有定位在小核上，表明全長(zhǎng) Mlh1入核后很快發(fā)生了水解。在有性生殖早期， HA-Mlh1定位在小核上，且定位信號(hào)不斷擴(kuò)大，定位模式類似于紡錘體結(jié)構(gòu)。在Crescent時(shí)期，HA-Mlh1可以與α-tubulin共定位于小核上。在小核完成第二次減數(shù)分裂后，HA

6、-Mlh1定位信號(hào)消失。結(jié)果表明，Mlh1參與減數(shù)分裂小核的拉伸。
　　3. MLH1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致四膜蟲(chóng)異常的有性生殖0.15μg/ml的Cd2+誘導(dǎo)生長(zhǎng)期突變株2 h，通過(guò)DAPI染細(xì)胞核DNA，顯微鏡下進(jìn)行突變株有性生殖時(shí)期核發(fā)育觀察，發(fā)現(xiàn)突變株在有性生殖期間出現(xiàn)無(wú)規(guī)則的小核和松散的染色質(zhì)，突變株不能完成有性生殖。核發(fā)育概率統(tǒng)計(jì)顯示，MLH1的過(guò)表達(dá)抑制了合子核的形成和發(fā)育，減數(shù)分裂后形成的配子大部分凋亡，少部分能發(fā)育到anl

7、agen時(shí)期，之后配對(duì)細(xì)胞分開(kāi)。
　　4. MLH1的敲除影響四膜蟲(chóng)的有性生殖構(gòu)建敲除載體pBsr-MLH1后，基因槍轉(zhuǎn)化入四膜蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)殺稻溫菌素梯度濃度篩選得到穩(wěn)定突變株ΔMLH1。缺對(duì)PCR檢測(cè)結(jié)果表明突變株存在小核染色體的丟失。核發(fā)育概率統(tǒng)計(jì)和γ-H2A.X定位信號(hào)結(jié)果顯示，突變株在第二次減數(shù)分裂后，選擇核不能完成DNA斷裂修復(fù)，之后配子凋亡。結(jié)果暗示，MLH1的缺失會(huì)影響選擇核的DNA斷裂修復(fù)，進(jìn)而影響合子核的發(fā)育及

8、后期的有性生殖進(jìn)程。Mlh1可能和DNA損傷修復(fù)相關(guān)。
　　5. MLH1和HMGB3可能存在功能上的補(bǔ)償通過(guò)四膜蟲(chóng)功能基因組數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)MLH1和高遷移率蛋白HMGB3有著相似的表達(dá)圖譜。此外，Mlh1和HmgB3有著相似的一級(jí)氨基酸序列結(jié)構(gòu)特性。RT-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)在ΔMLH1細(xì)胞中，HMGB3的表達(dá)水平較野生型細(xì)胞有了明顯的提高；在ΔHMGB3細(xì)胞中，MLH1的表達(dá)量也較野生型細(xì)胞有了明顯的提升。 MLH1和HMGB

9、3的雙敲除突變株對(duì)MMS較為敏感，且有性生殖缺陷比 MLH1的單敲除細(xì)胞株表型嚴(yán)重。以上結(jié)果表明 MLH1和HMGB3可能存在功能上的補(bǔ)償作用。
　　本研究首次對(duì)MLH1在四膜蟲(chóng)有性生殖時(shí)期的定位和功能進(jìn)行了系統(tǒng)分析；有性生殖早期，HA-Mlh1定位在小核上，且定位信號(hào)不斷擴(kuò)大，定位模式類似于紡錘體結(jié)構(gòu)。在Crescent時(shí)期，HA-Mlh1可以與α-tubulin共定位于小核上。MLH1的過(guò)表達(dá)不僅抑制了合子核的形成和發(fā)育，還形