WDHD1在HPV E7誘發(fā)的宮頸癌及其他腫瘤細(xì)胞中的功能及調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 WDHD1在人乳頭瘤病毒HPV E7誘發(fā)的腫瘤形成中的作用
　　用一種永生化的角質(zhì)化細(xì)胞Spontaneously immortalized human foreskinkeratinocytes(NIKS)，我們利用RNA-seq技術(shù)將E7表達(dá)細(xì)胞與對照細(xì)胞全基因組范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序與分析。共發(fā)現(xiàn)有237個基因在E7表達(dá)細(xì)胞與對照細(xì)胞之間存在明顯表達(dá)差異，其中150個基因

2、在E7表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，87個基因在E7表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性，我們基于E7相關(guān)的生物學(xué)功能選擇了12個基因分別在NIKS（包含E7表達(dá)細(xì)胞以及對照細(xì)胞）和原代角質(zhì)化細(xì)胞PHKs（包含E7表達(dá)細(xì)胞以及對照細(xì)胞）細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因與RNA-seq分析結(jié)果一致，而且E7表達(dá)細(xì)胞與對照細(xì)胞之間的差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。
　　接下來我們對E7表達(dá)細(xì)胞中具有差異表達(dá)的237種基因

3、進(jìn)行生物信息學(xué)的分析，通過GO(Gene Ontology)注釋和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes)數(shù)據(jù)庫聚類分析發(fā)現(xiàn)與DNA復(fù)制、DNA修復(fù)以及核苷酸代謝等促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展的信號通路在E7表達(dá)細(xì)胞中明顯上調(diào)，而參與程序性細(xì)胞死亡以及分解代謝調(diào)節(jié)的信號通路在E7表達(dá)細(xì)胞中明顯下調(diào)?？紤]到與細(xì)胞周期和DNA復(fù)制通路相關(guān)的基因在E7表達(dá)細(xì)胞中明顯失調(diào)，我們選擇了參與DNA復(fù)制和G1檢驗(yàn)點(diǎn)

4、調(diào)節(jié)的WDHD1進(jìn)行了進(jìn)一步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WDHD1的mRNA及蛋白水平在E7表達(dá)細(xì)胞中均升高，而低危型E7(6E7)并不能使WDHD1 mRNA及蛋白水平升高。我們同時也發(fā)現(xiàn)WDHD1在E7表達(dá)細(xì)胞中的半衰期比對照細(xì)胞明顯延長。
　　為了檢測WDHD1在E7表達(dá)細(xì)胞中能否發(fā)揮其細(xì)胞周期調(diào)控的作用，我們首先加入博來霉素使對照細(xì)胞不能越過G1檢驗(yàn)點(diǎn)的情況下，E7細(xì)胞仍然能夠越過G1檢驗(yàn)點(diǎn)，接著分別轉(zhuǎn)入WDHD1的兩個小干擾序列，結(jié)果

5、發(fā)現(xiàn)隨著WDHD1的敲除，細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。這表明WDHD1蛋白通參與調(diào)控E7細(xì)胞G1檢測點(diǎn)。值得注意的是，當(dāng)E7表達(dá)細(xì)胞部分敲除WDHD1達(dá)到和對照細(xì)胞表達(dá)量相同時，也就是不影響細(xì)胞的正常DNA復(fù)制時，該細(xì)胞仍然停滯G1期。這表明WDHD1蛋白是通過一種非依賴與DNA復(fù)制起始的機(jī)制，進(jìn)一步調(diào)控E7細(xì)胞G1檢測點(diǎn)。為了更直接驗(yàn)證WDHD1促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期的功能，我們采取了BrdU的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在E7表達(dá)細(xì)胞中當(dāng)敲除WDHD1后Brd

6、U的插入量明顯減少。這些均表明在HPV E7表達(dá)細(xì)胞中WDHD1在細(xì)胞周期G1期調(diào)控以及S期的進(jìn)入過程均發(fā)揮著重要作用。
　　我們最近研究表明，HPV-16 E7表達(dá)細(xì)胞在DNA損傷情況下會發(fā)生重復(fù)復(fù)制，并且DNA復(fù)制的啟動因素Cdt1在此過程中扮演著重要的角色。既然WDHD1被認(rèn)為是DNA復(fù)制起始因子，那么它是否影響E7細(xì)胞的重復(fù)復(fù)制呢？首先我們將E7表達(dá)細(xì)胞同步化在G1期，然后進(jìn)行不同時間點(diǎn)的釋放，發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長細(xì)胞發(fā)生了

7、重復(fù)復(fù)制。當(dāng)敲除WDHD1后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的重復(fù)復(fù)制是明顯降低的。那么在E7表達(dá)細(xì)胞中WDHD1是如何調(diào)控重復(fù)復(fù)制的呢？已知DNA復(fù)制起始因子招募MCM家族成員到復(fù)制起始區(qū)域從而啟動DNA復(fù)制，WDHD1的HMG box也具有與DNA結(jié)合的特性，因此WDHD1是否會通過MCM家族的成員來調(diào)控DNA復(fù)制呢？結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)MCM3結(jié)合到E7表達(dá)細(xì)胞啟動子區(qū)域的量要高于對照細(xì)胞，而當(dāng)敲除WDHD1后MCM3結(jié)合到啟動子區(qū)域的量是下降的，同時WDHD1

8、也能夠影響MCM3的mRNA及蛋白水平。當(dāng)敲除MCM3后細(xì)胞的重復(fù)復(fù)制也是明顯降低的。
　　綜上所述，WDHD1蛋白能夠調(diào)控E7細(xì)胞的G1檢驗(yàn)點(diǎn)及DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制，這些過程主要是依賴與WDHD1調(diào)控MCM3來完成的。
　　第二部分 WDHD1在HPV誘發(fā)的腫瘤及其他腫瘤中的調(diào)節(jié)機(jī)制
　　人類的多種疾病包括癌癥、自身免疫系統(tǒng)疾病以及炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展都有細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STATs）的參與。STATs家族

9、成員含有多個保守結(jié)構(gòu)域和功能性結(jié)構(gòu)域,其中最為保守的結(jié)構(gòu)域是SH2結(jié)構(gòu)域。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，STAT3作為轉(zhuǎn)錄因子其SH2結(jié)構(gòu)域與受體上被磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，同時STAT3自身發(fā)生磷酸化。STAT3在細(xì)胞內(nèi)起著重要的信號傳遞作用,主要負(fù)責(zé)將細(xì)胞外的信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)一步與靶基因啟動子結(jié)合從而誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄。目前許多STAT3的靶基因已被確定，包含編碼抗凋亡蛋白的Bcl-2、Bcl-X和Mcl-1，增值相關(guān)蛋白Myc和Cyclin

10、 D1，以及促血管生成因子VEGF等。
　　通過對RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)STAT3在E7細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著舉足輕重的作用。首先STAT3和WDHD1的mRNA水平在E7細(xì)胞中均是升高的，另外我們發(fā)現(xiàn)WDHD1啟動子區(qū)域有3個STAT3的結(jié)合位點(diǎn)。那么STAT3是否具有WDHD1調(diào)控細(xì)胞DNA復(fù)制的功能以及是否能調(diào)控WDHD1呢？以下的所有數(shù)據(jù)在E7表達(dá)細(xì)胞、腸癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞等多種細(xì)胞中均得到了驗(yàn)

11、證，篇幅所限，我們將展示腸癌和乳腺癌細(xì)胞的結(jié)果。
　　我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，敲除STAT3后細(xì)胞DNA復(fù)制減少，而將STAT3過表達(dá)后細(xì)胞的DNA復(fù)制會增多，說明STAT3在DNA復(fù)制過程中起作用。MLN4924可以誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞HCT116發(fā)生重復(fù)復(fù)制，當(dāng)敲除STAT3后細(xì)胞重復(fù)復(fù)制明顯減少，提示STAT3在重復(fù)復(fù)制過程中也發(fā)揮作用。當(dāng)用STAT3的激活因子IL-6以及EGF處理后發(fā)現(xiàn)WDHD1的mRNA也是增多的。既

12、然STAT3不僅具有影響DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制的功能，而且影響WDHD1的mRNA以及蛋白水平，那么STAT3是如何調(diào)控WDHD1的呢？STAT家族識別的經(jīng)典DNA結(jié)合序列是TTCC(C or G)GGAA(或TTN5AA)，且我們發(fā)現(xiàn)WDHD1啟動子區(qū)域有3個STAT3的結(jié)合位點(diǎn)。我們通過實(shí)驗(yàn)證明STAT3確實(shí)能夠通過結(jié)合該3個位點(diǎn)來啟動WDHD1的轉(zhuǎn)錄。
　　以上結(jié)果說明，STAT3能夠調(diào)控WDHD1，當(dāng)STAT3表達(dá)下降時細(xì)胞

13、的DNA復(fù)制及重復(fù)復(fù)制均減少。那么在STAT3表達(dá)下降的前提下再高表達(dá)WDHD1（使WDHD1表達(dá)量恢復(fù)到原水平），下降的DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制會恢復(fù)嗎？結(jié)果發(fā)現(xiàn)由STAT3的減少引起的細(xì)胞DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制在WDHD1重新高表達(dá)的情況下又恢復(fù)了。
　　綜上所述，STAT3可以通過與WDHD1啟動子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合從而促進(jìn)WDHD1基因轉(zhuǎn)錄，WDHD1通過影響MCM3進(jìn)而影響細(xì)胞DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制。我們的研究闡明了高危型HPV