HPV16 E6、E7 siRNA作用于宮頸癌細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：高危型HPV整合到人染色體后，其原癌基因E6、E7及所表達(dá)的原癌蛋白在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要的作用。本實(shí)驗(yàn)使用特異的靶向于HPV16 E6、E7基因的siRNA作用于表達(dá)HPV16陽(yáng)性的人宮頸鱗癌細(xì)胞株CaSki和SiHa，觀察其對(duì)HPV16E6、E7基因的特異性抑制作用，為探討使用siRNA治療宮頸癌的可行性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1.分別設(shè)計(jì)并合成靶向于HPV16 E6、E7的siRNA各3條(E6-1

2、 siRNA、E6-2 siRNA、E6-3 siRNA、E7-1 siRNA、E7-2 siRNA和E7-3 siRNA)、用作陽(yáng)性對(duì)照的β-actin siRNA和陰性對(duì)照的NControl siRNA。一部分NControl siRNA帶熒光標(biāo)記(FAM-NControl siRNA)，使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染CaSki和SiHa，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。 2.β-actin siRNA分別轉(zhuǎn)染兩株細(xì)胞，RT-PCR和We

3、stern Blot方法檢測(cè)β-actin mRNA和蛋白表達(dá)的變化情況。 3.E6-1、E6-2、E6-3 siRNA和E7-1、E7-2、E7-3 siRNA分別轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，使用RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)E6、E7 mRNA和蛋白的變化情況，各篩選出一條對(duì)靶基因干擾效率較高的siRNA。 4.將篩選出的E6-1 siRNA和E7-2 siRNA分別轉(zhuǎn)染兩株細(xì)胞，RT-PCR和Western

4、Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24、48、72及96 h E6、E7 mRNA和蛋白的變化情況。 結(jié)果： 1.熒光顯微鏡照片顯示FAM-siRNA已轉(zhuǎn)染進(jìn)兩株細(xì)胞。 2.β-actin siRNA轉(zhuǎn)染CaSki和SiHa后，同對(duì)照組相比，其β-actin mRNA和蛋白均顯著降低(P＜0.05)，而脂質(zhì)體組的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。 3.同對(duì)照組相比，E6、E7 siRNA均可引起靶基因表達(dá)水平的顯著性下降(P＜0.

5、05)。E6-1 siRNA和E7-2 siRNA對(duì)靶基因抑制作用較強(qiáng)。 4.E6-1 siRNA和E7-2 siRNA轉(zhuǎn)染兩株細(xì)胞后24 h、48 h、72 h及96 h均可觀察到靶基因表達(dá)的顯著性降低(P＜0.05)，而對(duì)相應(yīng)的非靶基因無(wú)明顯抑制作用。 結(jié)論： 1.化學(xué)合成的siRNA可以通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體成功轉(zhuǎn)染人宮頸鱗癌細(xì)胞株。 2.不同序列的E6、E7 siRNA，對(duì)靶基因的干擾效率不同。在本實(shí)驗(yàn)