異丙酚后處理對抗心肌缺血的促生存效應(yīng)機制研究.pdf

1、背景：
　　 實驗證明缺血后處理(ischemic postconditioning，I-postC）可以明顯對抗心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷。藥物性后處理在缺血后處理（I-postC）的基礎(chǔ)上提出，既不損傷器官又能產(chǎn)生缺血后處理效應(yīng)，更具臨床應(yīng)用價值。
　　 已有實驗證明揮發(fā)性麻醉藥如異氟醚、七氟醚后處理具有心肌保護作用，那么靜脈麻醉藥物異丙酚后處理是否具有心肌保護作用尚需研究

2、證明。實驗證明，異丙酚可以通過減少中性粒細(xì)胞集聚、改善冠狀動脈內(nèi)皮功能、減少活性氧的產(chǎn)生以及降低線粒體內(nèi)鈣濃度等途徑保護心肌。近期研究發(fā)現(xiàn)主動效應(yīng)在心肌保護作用中占據(jù)著更為重要的位置，細(xì)胞在受損同時，能夠啟動一系列主動效應(yīng)，激發(fā)細(xì)胞本身的內(nèi)源性抗損傷能力，增強細(xì)胞自我保護能力，稱之為促生存效應(yīng)。那異丙酚后處理是否通過激活心肌細(xì)胞自我保護機制，從而發(fā)揮促生存效應(yīng)呢？本課題擬從細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬以及促生存信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面對異丙酚后處理的心

3、肌保護作用機制進行研究。
　　 第一部分心肌細(xì)胞培養(yǎng)以及缺氧復(fù)氧模型的建立及評價
　　 目的：
　　 探討心肌細(xì)胞分離、純化和培養(yǎng)方法；建立培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧實驗?zāi)Ｐ筒ζ溥M行評價。
　　 方法：
　　 通過用改良的新生小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法，選取新生1天內(nèi)SD大鼠，采用胰蛋白酶和膠原酶共同消化的方法分離出心肌細(xì)胞，結(jié)合差速貼壁和化學(xué)試劑抑制法純化。原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞培養(yǎng)4天后，更換用無血清低糖培養(yǎng)

4、基于常規(guī)培養(yǎng)箱中過夜同步化。造模前換用平衡過的無血清低糖的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于厭氧培養(yǎng)箱或缺氧小室中培養(yǎng)。缺氧后，將細(xì)胞從厭氧培養(yǎng)箱或缺氧小室中取出，更換用含有血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時復(fù)氧。
　　 結(jié)果：
　　 原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞呈島嶼狀的自發(fā)性搏動，頻率為90-150次/分。臺盼藍排斥實驗證實心肌細(xì)胞成活率95.5％。心肌細(xì)胞內(nèi)特異性肌動蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性表達率為95％。造模后心

5、肌細(xì)胞均出現(xiàn)皺縮，搏動性降低等心肌細(xì)胞受損的特征性表現(xiàn)，隨著缺氧時間的延長心肌細(xì)胞受損加重。3小時，6小時缺氧細(xì)胞受損不明顯，但缺氧時間超過12 h時，細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)基中造成較大誤差，所以本實驗的時間組別均設(shè)置12 h 缺氧4小時復(fù)氧。
　　 結(jié)論：
　　 原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞存活率高，純度高符合實驗要求。厭氧培養(yǎng)箱和缺氧小室均可模擬心肌細(xì)胞的缺氧環(huán)境，并且可以造成較為穩(wěn)定的損傷。
　　 第二部分異丙酚后處理對抗心肌

6、缺血再灌注損傷中ERK/NF-κB信號通路作用研究目的：
　　 應(yīng)用原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，在心肌細(xì)胞復(fù)氧同時給予濃度梯度的異丙酚進行后處理，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)變化、凋亡情況以及ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面研究異丙酚后處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用并探索其促生存信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　 方法：
　　 采用MTT 法檢測異丙酚后處理對缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞活力的影響；采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧；采用流式細(xì)胞儀A

7、nnexin Ⅴ-FITC/PI 雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡率；Real-time PCR 檢測凋亡相關(guān)基因caspase-3 mRNA表達的變化；western blot檢測ERK蛋白磷酸化表達水平變化；免疫熒光染色檢測NF-κB 亞基p65的核移位。
　　 應(yīng)用ERK 特異性抑制劑U0126對ERK 磷酸化水平以及NF-κB 亞基p65的核移位的影響。
　　 結(jié)果：
　　 MTT 結(jié)果顯示異丙酚后處理能夠顯著提高缺氧

8、復(fù)氧心肌細(xì)胞活力且在50μM以下呈濃度依賴性，50μM 以上細(xì)胞活力進入平臺期。與此同時異丙酚后處理可以降低心肌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。熒光顯微鏡下，正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞無明顯凋亡細(xì)胞，而缺氧復(fù)氧處理組可見部分細(xì)胞胞體縮小，胞質(zhì)濃縮，可見典型的新月形的凋亡小體。
　　 相反在心肌細(xì)胞復(fù)氧同時給予異丙酚處理，可見鏡下凋亡小體明顯減少。流式細(xì)胞儀Annexin Ⅴ/PI 雙標(biāo)檢測凋亡率結(jié)果顯示異丙酚后處理能夠減少缺氧復(fù)氧所致的心肌細(xì)胞凋亡，

9、早期凋亡細(xì)胞（Annexin Ⅴ+/PI-）占總細(xì)胞數(shù)的比例減小，同時相應(yīng)可抑制凋亡基因caspase-3 mRNA表達。Western blotting的結(jié)果顯示缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞組的磷酸化的ERK1/2表達量較正常對照組有微量上調(diào)，然而異丙酚后處理可以大幅度激活ERK/MAPK 導(dǎo)致ERK的磷酸化蛋白表達增多，并且大部分依賴于異丙酚后處理的作用。ERK的特異性抑制劑U0126幾乎可以完全抑制ERK1/2的磷酸化表達。
　　 缺

10、氧復(fù)氧組中心肌細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白表達量增多，異丙酚后處理組后，NF-κBp65蛋白發(fā)生核移位的細(xì)胞數(shù)減少比較明顯。ERK的特異性抑制劑U0126 可以消除異丙酚后處理對NF-κB p65 核位移的抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　 異丙酚缺血后處理對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞有保護作用，可提高受損心肌的活力并減少凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量以及抑制凋亡基因caspase-3 mRNA表達，其保護機制可能包括減低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，抑制N

11、F-κB 亞基p65的核移位。同時，對于ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究表明異丙酚后處理的保護作用可能是通過激活ERK 以抑制NF-κB核位移從而調(diào)控下游一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達調(diào)控而實現(xiàn)的。
　　 第三部分異丙酚后處理中細(xì)胞自噬的保護作用以及相關(guān)JNK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究
　　 目的：
　　 針對異丙酚后處理對抗心肌缺血再灌注損傷過程中細(xì)胞自噬機制及與細(xì)胞凋亡關(guān)系進行系統(tǒng)性研究。在心肌細(xì)胞復(fù)氧同時給予濃度梯

12、度的異丙酚進行后處理，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞自噬與凋亡情況以及JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面研究異丙酚后處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用并探索其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　 方法：
　　 采用MTT 法檢測異丙酚后處理對缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞活力的影響；采用流式細(xì)胞儀Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡率；Monodansylcadaverine (MDC)染色以及吖啶橙(Acridine orange，AO)染色

13、檢測細(xì)胞酸性空泡積聚情況；western blot檢測異丙酚后處理對LC3I 型向Ⅱ型轉(zhuǎn)化的影響以及JNK蛋白磷酸化表達水平變化的影響；應(yīng)用自噬抑制劑3-MA 以及JNK 抑制劑SP60125 觀察對心肌細(xì)胞自噬觸發(fā)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 應(yīng)用Western blot 檢測LC3 I 向II 型轉(zhuǎn)化的方法，目前也已基本成為檢測自噬發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)。MDC 染色和AO 染色作為輔助手段可以檢測細(xì)胞中的嗜酸性小體，說明溶酶

14、體活性上升，間接提示自噬的發(fā)生。這幾個實驗的陽性結(jié)果證明在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中，可以被異丙酚后處理誘導(dǎo)進一步發(fā)生細(xì)胞自噬。并且，從LC3 I 向II 型轉(zhuǎn)化的趨勢判斷，自噬是隨著異丙酚后處理的濃度梯度增強的。我們使用3-MA 有效抑制心肌細(xì)胞發(fā)生自噬后，凋亡的的細(xì)胞由6.7％增加到15.6％。說明抑制自噬發(fā)生，可以對消除異丙酚后處理對心肌細(xì)胞的保護作用。異丙酚后處理在進一步激活細(xì)胞自噬的同時，JNK的磷酸化水平也得以提高，從而調(diào)控細(xì)胞自噬

15、的發(fā)生與發(fā)展。磷酸化形式的JNK 經(jīng)異丙酚后處理之后，呈濃度梯度性增加，說明該通路被有效的激活。
　　 JNK 特異性抑制劑SP600125 處理后的心肌細(xì)胞，無論是Westem blot 檢測LC3 I 至II 型的轉(zhuǎn)化，還是熒光顯微鏡下觀察均說明了自噬被抑制。同時，在細(xì)胞自噬被抑制的同時，JNK 特異性抑制劑SP600125 也可以抵消異丙酚后處理對心肌細(xì)胞的保護作用，從而證明JNK信號通路介導(dǎo)了缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞自噬