新型抗腫瘤制劑-基因重組Kringle5蛋白的藥效學與毒理學研究.pdf

1、人Pgn是分子量為92kD的糖蛋白,由一個絲氨酸蛋白酶結(jié)構域和5個通過二硫鍵連接的餅環(huán)區(qū)(Kringle)構成,每個餅環(huán)區(qū)由80個氨基酸組成,分子量約為14kD,含3個二硫鍵,形成雙環(huán)狀構象。Kringle5是Pgn的第五個餅環(huán)區(qū)結(jié)構,研究證實Kringle5在體外具有抑制內(nèi)皮細胞增殖、抑制內(nèi)皮細胞遷移的生物學活性,在體內(nèi)可抑制多種血管新生模型的新生血管形成(angiogenesis),進而可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,在實體瘤、糖尿病視網(wǎng)膜

2、病變、風濕性關節(jié)炎等疾病的治療中有廣泛的應用前景。
　　 Kringle5含有由3個二硫鍵形成的Kringle結(jié)構和Kringle結(jié)構外側(cè)的2個臂,本研究構建的Kringle5蛋白去除了這2個臂而保留了3個二硫鍵的完整結(jié)構。本研究在我室前期對Kringle5實驗室規(guī)模研究(見第一章)的基礎上,對Kringle5的生產(chǎn)制備工藝(見第二章和第三章)進行了研究,建立了Kringle5的制備工藝；本研究進一步對Kringle5的生物學活

3、性進行了深入研究,包括對Kringle5體外抑制血管內(nèi)皮細胞增殖的效果和機制(見第四章第一節(jié))進行了研究、對Kringle5體外抑制血管內(nèi)皮細胞遷移和血管形成的效果(見第四章第二節(jié))進行了研究、對Kringle5抑制小鼠移植瘤的效果和機制(見第四章第三節(jié))進行了研究,這些工作為Kringle5蛋白的生物制劑的開發(fā)奠定了重要基礎；同時,本研究還采用急性經(jīng)口毒性試驗(見第五章第一節(jié))、遺傳毒性試驗(見第五章第二節(jié))和大鼠30d喂養(yǎng)試驗(見第

4、五章第三節(jié))對Kringle5的毒理學進行了系統(tǒng)研究。本研究是新型抗腫瘤制劑-Kringle5蛋白的新藥申報材料的核心組成部分,為Kringle5蛋白的新藥開發(fā)奠定了基礎。
　　 1基因重組Kringle5蛋白的原核表達體系的建立
　　 本研究以纖溶酶原cDNA為模板,PCR擴增了Kringle5基因,經(jīng)過適當酶切后構建表達載體pBV220/Kringle5,轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109進行溫控誘導表達,表達產(chǎn)物經(jīng)純化、復性后

5、檢測其抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管新生的生物學活性。實驗結(jié)果證實帶有重組質(zhì)粒pBV220/Kringle5的大腸桿菌經(jīng)溫控誘導后可表達目的蛋白,其表達量占菌體總蛋白總量的34.8％,免疫學鑒定結(jié)果表明該異源重組蛋白具有His-tag抗原活性,CAM實驗證實具有抑制血管新生的野生活性。
　　 JM109/pBV220/Kringle5表達系統(tǒng)屬于PRPL串聯(lián)雙啟動子的高效原核基因表達系統(tǒng),該系統(tǒng)可在4-5h內(nèi)表達Kringle

6、5蛋白占菌體總蛋白的34.8％,表達的量較高,經(jīng)純化、復性后獲得的Kringle5蛋白具有抑制血管新生的生物學活性。
　　 本研究構建的JM109/pBV220/Kringle5表達體系具有以下特點:①表達量高:在以上的研究中我們發(fā)現(xiàn),該表達體系表達的蛋白占菌體總蛋白的34.8％,符合發(fā)酵生產(chǎn)需要；②該技術體系表達的Kringle5蛋白,其羧基端有6個組氨酸鏈,簡化了該蛋白的分離、純化的基因工程下游工藝,也使該技術體系對于獲取該

7、蛋白提供了簡要的技術體系。③為該蛋白的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定了實驗基礎:本原核表達體系一方面保證了蛋白表達的量較高,使原料能合理利用,降低了生產(chǎn)成本；同時,使該蛋白的分離純化體系簡化,客觀上為其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展準備了條件。本研究為進一步將Kringle5蛋白開發(fā)成新型抗腫瘤藥物奠定了實驗技術基礎。
　　 2基因重組Kringle5蛋白的發(fā)酵制備工藝研究
　　 本研究在本實驗室成功構建了Kringle5的原核表達體系并證明獲得的基因重組

8、Kringle5蛋白具有抑制CAM血管生長活性的基礎上,應用高密度發(fā)酵法建立并優(yōu)化了Kringle5蛋白的發(fā)酵技術,采用比濁法檢測菌體密度、稱重法監(jiān)測菌體重量、SDS-PAGE凝膠電泳檢測Kringle5表達量。研究結(jié)果顯示,Kringle5基因重組蛋白基因工程菌高密度發(fā)酵的優(yōu)化條件為:取-70℃20％甘油保藏的BP-5菌種,立即置于水浴中溶解,在超凈工作臺內(nèi)取滅菌接種環(huán)涂劃含50μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板,置30℃溫箱過夜；從

9、平板上挑取單菌落,接種于5mL LB中(含100μg/mL Amp),然后于30℃搖床振蕩12h,成為活化一級發(fā)酵種子；取活化菌種,按1:50接種量接種于盛有300mL的LB的三角搖瓶中(含100μg/mL Amp),在空氣浴搖床中,30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h,即為二級發(fā)酵種子液:發(fā)酵培養(yǎng)基選用LB-2×YT,體積均為3.0L,加3mL食用油作為防泡劑,在120℃滅菌20min后冷卻至30℃；加Amp10g,接種子液300m

10、L:細菌接種后30℃進行基礎培養(yǎng)的時間為7h,以10mL/h的速度開始流加補料培養(yǎng)基,隨后流加速度以10mL/h逐漸遞加；于42℃加入誘導培養(yǎng)6h。pH由1mol/L HCl與25％氨水控制于7.0,空氣流量為1vvm,溶氧控制始終大于50％,攪拌轉(zhuǎn)速控制為800-1200r/min；經(jīng)15％的SDS-PAGE電泳圖像分析系統(tǒng)掃描分析,目的蛋白占到全菌總蛋白的38.4％,菌體干重達到14.28±0.11g/L。本研究建立并優(yōu)化了Krin

11、gle5蛋白的原核高密度發(fā)酵工藝,為其新藥開發(fā)奠定了技術基礎。
　　 3基因重組Kringle5蛋白的純化工藝研究
　　 固定金屬親和層析(IMAC)是近年來發(fā)展起來的一種親和方法,其固定相基質(zhì)上鰲合了一些金屬離子,如Cu2+、Ni2+、Fe3+等,其配基為側(cè)鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽,特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結(jié)構最易結(jié)合到金屬離子親和柱上,純化效果較好。本課

12、題中,Kringle5的純化方法的設計是基于其N端設計有6個His組成的His標簽。His的咪唑環(huán)作為電子供體容易與固定的金屬離子形成配位鍵,含有連續(xù)His殘基序列的多肽可在IMAC中有效保留?；|(zhì)材料洗滌之后可通過調(diào)節(jié)柱緩沖液的pH或添加游離咪唑洗脫含多聚His的多肽。本研究分別使用Chelating Sepharose Fast Flow填料,鰲合NiSO4后,利用Pharmacia Biotech GradiFrac控制臺,分別采

13、用pH梯度洗脫和咪唑梯度洗脫的方法探究了Kringle5的純化方法。本實驗中我們對兩種不同的目的蛋白洗脫的方法進行了研究,我們優(yōu)選pH梯度洗脫法對Kringle5進行純化。
　　 研究結(jié)果顯示,用10倍柱體積的Binding Buffer E洗至基線平穩(wěn)；將樣品加到層析柱中,室溫靜止30min后流速控制在15ml/h左右,收集穿透部分；層析用5倍柱體積(約50ml)的Binding Buffer E洗,流速控制在30ml/h左右

14、；分別用5倍柱體積(約50ml)ElutingBuffer F,Eluting Buffer G,Eluting Buffer H洗脫,流速控制在15ml/h左右,監(jiān)測A280并收集洗脫液；經(jīng)SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn),上樣峰中前部分為穿透峰,后半部分為非特意結(jié)合雜蛋白峰,洗脫峰均為Kringle5,蛋白純度在98％以上,pH梯度洗脫的蛋白得率為62.7mg/柱體積。本研究建立的Kringle5純化方法為后續(xù)Kringle5蛋白的生物學活

15、性研究奠定了實驗基礎。
　　 4基因重組Kringle5蛋白的藥效學研究
　　 纖溶酶原Kringle5能抑制內(nèi)皮細胞增生,且其活性比血管抑素(即Kringlel-4,angiostatin)更強。Kringle5抑制血管生長因具有高效、高細胞選擇性以及短的氨基酸序列的特點,而具有治療血管增生性疾病的潛在臨床應用價值。
　　 4.1基因重組Kringle5抑制血管內(nèi)皮細胞增殖的實驗研究
　　 本研究采用體

16、外實驗的方法用Kringle5和血管抑素干預VEC-304的生長,觀察我室制備的原核表達Kringle5重組蛋白的藥效學效果。實驗結(jié)果顯示:①本研究獲得的基因重組Kringle5蛋白抑制VEC-300的ED50為0.25(0.06,0.88)μmol/L;②從Kringle5對VEC-304細胞結(jié)構的影響、對DNA的斷裂作用、細胞膜和細胞核的變化、細胞周期的改變和Procaspase3的表達變化等5個方面的研究結(jié)果顯示,Kringle5

17、處理的VEC-304細胞表面微絨毛表現(xiàn)為脫落或消失；形成了顯著的DNA Ladder且初步結(jié)果顯示Kringle5的致凋亡作用有劑量依賴性；作用于VEC-30412h后出現(xiàn)為早期凋亡,作用3d后出現(xiàn)細胞核固縮、裂解；凋亡細胞的百分率、G0/G1期細胞數(shù)隨Kringle5濃度的遞增而增加,細胞被阻滯于G0/G1期；Kringle5蛋白對VEC-304細胞的致凋亡作用有時間依賴性,在作用4h后即出現(xiàn)凋亡的跡象,8—12h達到最大。證實了本工

18、藝制備的基因重組Kringle5蛋白對血管內(nèi)皮細胞的致凋亡作用。⑨采用Caspase3抗體等對其機制進行了研究,證實Kringle5誘導VEC-304細胞凋亡可能通過激活胞內(nèi)的Caspase3介導的凋亡途徑和阻遏細胞循環(huán)兩條途徑實現(xiàn)的。本研究為基因重組Kringle5蛋白的臨床應用奠定了理論基礎。
　　 4.2基因重組Kringle5蛋白抑制內(nèi)皮細胞遷移的實驗研究
　　 腫瘤組織內(nèi)新生血管形成是由刺激血管生長因子誘導血管

19、內(nèi)皮細胞增殖和游走運動,從而誘生血管芽生成。內(nèi)皮細胞作為血管形成因子的效應細胞,在腫瘤血管形成中起關鍵性的作用,所以對內(nèi)皮細胞的增殖或遷移的干擾能力是有效的抗血管形成藥物的重要特征。本研究采用缺損閉合實驗、誘導VEC-304細胞遷移實驗和體外血管形成實驗檢測Kringle5抑制VEC-304細胞遷移和體外血管形成效果,為其臨床應用奠定實驗基礎。
　　 本研究結(jié)果顯示,100μmol/L的Kringle5作用后4d和6d兩組缺損面

20、積的差異具有顯著性,隨著干預時間的延長,缺損周圍的VEC-304細胞在向缺損生長,但是Kringle5組的缺損面積卻沒有增大；加入條件培養(yǎng)基對內(nèi)皮細胞作用6 h后,用U14細胞制備條件培養(yǎng)基1表現(xiàn)出對內(nèi)皮細胞更強的吸引作用,細胞計數(shù)顯著高于含有Kringle5蛋白的條件培養(yǎng)基,其抑制U14細胞條件培養(yǎng)基誘導的VEC-304細胞遷移的ED50為70.60(56.05,91.85)μmol/L；Kdngle5蛋白抑制VEC-304細胞遷移的

21、ED50為36.44μmol/L；當有U14細胞存在時,遷移的細胞數(shù)明顯增加,Kringle5蛋白使遷移細胞數(shù)顯著減少,并呈劑量依賴性,Kringle5蛋白抑制U14細胞誘導的VEC-304細胞遷移的ED50為13.04(3.86,33.81)μmol/L；體外血管形成試驗中,Kringle5組中VEC-304細胞形成的網(wǎng)格結(jié)構較小且有較多的VEC-304細胞并未參與形成網(wǎng)格結(jié)構而置于網(wǎng)格之間。說明Kringle5蛋白具有抑制血管生成的

22、作用,其作用機制可能是通過抑制內(nèi)皮細胞遷移和內(nèi)皮細胞增殖,從而抑制新生血管生成。
　　 4.3基因重組Kringle5蛋白對小鼠轉(zhuǎn)移瘤的治療效果評價
　　 人們已致力于開發(fā)和研究破壞或抑制血管生成、有效地阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的藥物,這類藥物可切斷腫瘤賴以生長和轉(zhuǎn)移的營養(yǎng)來源和遷移通道,具有良好的特異性、劑量小、療效高、不易產(chǎn)生耐藥性、對正常組織毒性極小等優(yōu)點。本研究采用U14細胞懸液皮下種植建立小鼠移植瘤模型,將Kring

23、le5蛋白直接在瘤體內(nèi)注射,觀察瘤體大小,小鼠活動能力、飲食等狀況,以此來評價Kringle5蛋白治療的抑瘤能力,為其臨床應用奠定實驗基礎。
　　 本研究結(jié)果顯示,治療各組小鼠治療前后飲食、行為無明顯異常,反應能力、營養(yǎng)狀況良好；而陰性對照組小鼠隨著瘤體的增大,飲食、活動能力、反應能力逐漸變差,營養(yǎng)差,后期呈惡病質(zhì)態(tài),在給藥后第6天有1只小鼠死亡。初步說明本研究用Kringle5在荷瘤小鼠體內(nèi)未引起明顯的免疫反應,且對小鼠的生長

24、狀態(tài)有一定的改善作用。①從瘤體的生長速度分析,各治療組瘤體在治療后第5d增長速度即開始減慢,10d后體積增長明顯減慢,第20d時Kringle5低劑量組和Kringle5高劑量組瘤體體積分別為(20270.00±527.18)mm3、(11993.33±229.75)mm3,其中低劑量組與Angiostatin組無顯著性差異(P>0.05),而高劑量組的治療效果優(yōu)于Angiostatin組(P<0.01)；Kringle5高劑量+環(huán)磷酰

25、胺組的瘤體體積為(7298.33±496.12)mm3,顯著低于其他各組(P<0.01),說明Kringle5在腫瘤化療的過程中與化療藥物同時使用效果可達最佳,且可減少化療藥物的副作用的發(fā)生。②從瘤體的重量角度分析,Kringle5低劑量組和Kringle5高劑量組瘤體重量分別為(4.78±1.34)g、(3.82±1.16)g,其中低劑量組與Angiostatin組的抑瘤效果相似(P>0.05),而高劑量組的治療效果優(yōu)于Angiost

26、atin組(P<0.01)；Kringle5高劑量+環(huán)磷酰胺組的瘤體重量為(3.16±1.08)g,顯著低于其他各組(P<0.01),說明Kringle5可抑制瘤體腫瘤細胞的增殖,其機制可能是減少瘤體組織的血供、促進瘤細胞的凋亡而致。③從瘤體中血管形成的角度分析,使用CD31單抗檢測U14移植瘤中血管的形成和生長情況,可見陰性對照組(A組)的小鼠瘤體內(nèi)有分布不
　　 一、管腔不等的血管形成,而Kringle5高劑量組(D組)的血

27、管形成明顯減少,提示Kringle5具有抑制瘤體中血管新生的作用。
　　 對瘤體組織中相關基因的表達檢測結(jié)果顯示,Kringle5可抑制VEGF、IL-8的表達,說明在使用Kringle5治療腫瘤中可降低腫瘤中血管生長刺激因子的表達,對血管的新生有抑制作用,該結(jié)果與CD31單抗檢測瘤體組織血管分布相一致,初步說明Kringle5的抑瘤作用是通過抑制血管新生來實現(xiàn)的。Kringle5可抑制MMP-2、MMP-9的表達,而促進TIM

28、P-1、TIMP-2的合成,說明在使用Kringle5治療腫瘤中可同時降低腫瘤細胞的侵襲能力,在抑制腫瘤侵襲周圍正常組織中可能會起到重要作用。Kringle5蛋白可使瘤體中VE-cadherin表達量增加,而CD44V6的表達量減低,初步顯示Kringle5蛋白可能在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的過程中起重要的抑制作用。本研究闡明了Kringle5抑制小鼠移植瘤生長的效果和可能機制,為其臨床應用奠定了實驗基礎。
　　 5基因重組Kringle5

29、蛋白的毒理學研究
　　 本研究利用小鼠急性經(jīng)口毒性試驗、鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、大鼠30d喂養(yǎng)試驗等毒理學試驗方法檢測基因重組Kringle5蛋白在動物體內(nèi)的急性毒性、致突變作用和較長期接觸毒性,為基因重組Kringle5蛋白的臨床應用奠定實驗基礎。
　　 本研究結(jié)果顯示,基因重組Kringle5蛋白對兩種性別的SPF級昆明種小鼠的經(jīng)口毒性試驗中,二次灌胃總量達12.0

30、g/kg·bw,一周內(nèi)動物未見中毒癥狀,無動物死亡,按急性毒性分級標準規(guī)定,基因重組Kringle5蛋白屬實際無毒級。小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗三項致突變試驗結(jié)果均為陰性,說明基因重組Kringle5蛋白無致突變作用。Wistar大鼠30d喂養(yǎng)試驗結(jié)果表明:該受試物0.34、3.40、6.70g/kg·bw劑量分別相當于推薦人群日攝人量0.2g/kg·bw的20、50、100倍對Wista