重組鉤蟲(chóng)抗凝肽rAcaNAP9的原核表達(dá)、急性毒理學(xué)及藥效學(xué)初步研究.pdf

1、目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)前期已明確鉤蟲(chóng)抗凝肽AcaNAP9具有顯著體外抗凝活性,可能開(kāi)發(fā)為抗凝抗栓新藥。本論文通過(guò)在大腸桿菌中制備重組鉤蟲(chóng)抗凝肽rAcaNAP9,并對(duì)rAcaNAP9進(jìn)行急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)及初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn),將為AcaNAP9的應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.重組鉤蟲(chóng)抗凝肽rAcaNAP9的原核表達(dá)
　　 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET32a/AcaNAP9轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)并進(jìn)行誘

2、導(dǎo)表達(dá)。6-His親和層析純化重組蛋白,SDS-PAGE分析純化效果。純化的重組蛋白經(jīng)凝膠過(guò)濾層析除咪唑,內(nèi)毒素親和吸附除內(nèi)毒素后,用體外凝血酶原時(shí)間(PT)檢測(cè)體外抗凝活性。
　　 2.重組鉤蟲(chóng)抗凝肽rAcaNAP9的急性毒性實(shí)驗(yàn)
　　 將20只KM小鼠隨機(jī)分為2組。其中一組設(shè)為空白對(duì)照組,一次性按照0.2ml/10g體重iv給生理鹽水。另一組設(shè)為給藥組,一次性按照0.2ml/10g體重iv給藥12.67mg/mlAc

3、aNAP9。給藥后,記錄3周時(shí)間內(nèi)所有KM小鼠的生存狀況,之后處死所有小鼠,并進(jìn)行尸檢。
　　 3.重組鉤蟲(chóng)抗凝肽rAcaNAP9的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)
　　 將55只SD大鼠隨機(jī)分為rAcaNAP9低劑量組(40μg/kg)、中劑量組(200μg/kg)、高劑量組(1mg/kg)、肝素組(肝素鈉,1650U/kg)和模型對(duì)照組共5組。分離大鼠一側(cè)頸總動(dòng)脈,從鼠尾靜脈iv給藥后,立即用血栓生成儀對(duì)頸動(dòng)脈進(jìn)行恒流直流電刺激5min,

4、檢測(cè)受刺激血管的堵塞程度,并對(duì)各組電刺激5min后頸動(dòng)脈堵塞程度的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 平均100mlLB培養(yǎng)基可獲得25.43mg可溶性rAcaNAP9,測(cè)得rAcaNAP9體外抗凝活性為100nM rAcaNAP9延長(zhǎng)約5倍PT;在給藥后3周的觀察時(shí)間內(nèi),所有受試KM小鼠均存活且無(wú)任何異常表現(xiàn),處死后尸檢結(jié)果正常;在大鼠頸總動(dòng)脈血栓形成實(shí)驗(yàn)中,rAcaNAP9低、中劑量組頸動(dòng)脈堵塞程度和模型對(duì)照組

5、比較有顯著性差異(P＜0.05),rAcaNAP9高劑量組頸動(dòng)脈堵塞和模型對(duì)照組比較有極其顯著性差異(P＜0.01);rAcaNAP9低、中劑量組頸動(dòng)脈堵塞程度和肝素組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05),rAcaNAP9高劑量組頸動(dòng)脈堵塞和肝素組比較有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)中平均100mlLB培養(yǎng)基可獲得25.34mg可溶性rAcaNAP9,實(shí)現(xiàn)了重組鉤蟲(chóng)抗凝肽rAcaNAP9在大腸桿菌中

6、高效、可溶性表達(dá);所有受試KM小鼠在一次性接受了253.4mg/kg劑量的rAcaNAP9后三周內(nèi)均存活且無(wú)任何異常表現(xiàn)。處死后尸檢結(jié)果正常。證明重組鉤蟲(chóng)抗凝肽rAcaNAP9是一種毒性非常小、安全性較高的多肽;在大鼠頸總動(dòng)脈血栓形成實(shí)驗(yàn)中,rAcaNAP9低、中劑量組頸動(dòng)脈堵塞程度和模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05),rAcaNAP9高劑量組頸動(dòng)脈堵塞和模型對(duì)照組比較有極其顯著性差異(P＜0.01);rAcaNAP9高劑量組頸