固有免疫受體NOD2在心室重構中的作用及機制研究.pdf

1、研究目的
　　心室重構是指心室受到損傷時發(fā)生的結構和功能的改變，出現心肌細胞肥大、死亡、間質纖維化、心肌肥厚、心肌細胞膜離子通道、交感神經支配的變化等。許多心血管疾病如高血壓、心肌梗死、心力衰竭、擴張型心肌病、心臟瓣膜病等都存在心室重構現象，另外在高同型半胱氨酸血癥、動脈粥樣硬化、糖尿病等其他疾病并發(fā)癥中也存在心室重構現象。心室重構是多種因素共同作用所產生的形態(tài)學、分子生物學、病理生理學、電生理環(huán)境的變化，其機制主要包括炎癥反應、

2、血流動力學負荷、細胞因子生成和蛋白酶誘導的細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)降解。
　　NOD樣受體（NOD-likereceptor，NLRs）是一類新型胞漿內的固有免疫模式識別受體，識別細胞內病原體相關分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)或內源性危險信號相關分子(dangers-associatedmolecularpatterns，DAMP

3、s)，從而啟動免疫應答，在自身免疫調節(jié)中起重要作用。到目前為止，共發(fā)現了22個NLR家族成員，其中最具代表性的是NOD1(nucleotide-bindingoligomerizationdomaincontaining1)和NOD2(nucleotide-bindingoligomerizationdomaincontaining2)。有文獻報道，NOD1激動劑iEDAP注射小鼠心臟，激活NF-κB（nucleartranscript

4、ionfactorκB）和TGF-β（transforminggrowthfactorβ）信號通路，誘導心肌細胞壞死和凋亡進而導致心臟功能異常。但有關NOD2在心臟中表達及在心室重構中的作用，迄今尚未見報道。為此，本課題選用高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，hHcys)及心肌梗死（myocardialInfarction，MI）兩種不同程度的心室重構模型，探討NOD2是否參與心室重構過程，并就NOD2調節(jié)心室

5、重構過程的可能機制進行深入研究。
　　研究方法
　　第一部分:通過無葉酸飲食建立WT和CBS+/-小鼠高同型半胱氨酸血癥模型，利用小動物超聲心動圖檢測小鼠左心室內徑及心功能，WesternBlot、RT-PCR和免疫組化等方法檢測NOD2在心肌組織中的表達情況。體外實驗用不同濃度的L-Hcy刺激大鼠心肌細胞H9C2和平滑肌細胞(smoothmusclecell，SMC)，WesternBlot方法檢測NOD2的蛋白表達水平。

6、為探討NOD2在高同型半胱氨酸血癥心室重構中的機制，我們采用NOD2敲基因鼠建立高同型半胱氨酸血癥模型，進一步利用小動物超聲心動圖檢測小鼠左心室內徑及心功能指標，觀察NOD2對hHcys引起心室重構的影響;Masson染色觀察小鼠纖維化程度;通過WesternBlot方法檢測心室重構標志物基質金屬蛋白酶2(matrixmetalloproteinase2，MMP-2)、基質金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase9，

7、MMP-9)及基質金屬蛋白酶抑制劑1(tissueinhibitorofmetalloproteinase1，TIMP-1)等指標的表達變化。
　　第二部分:通過永久性結扎冠狀動脈左前降支建立小鼠心肌梗死模型。在心梗后3、7、14和28天分別收集梗死區(qū)和非梗死區(qū)的心肌組織，用實時熒光定量PCR檢測不同梗死時間后NOD2的mRNA表達水平，通過免疫組化染色和WesternBlot分析心梗NOD2的蛋白表達水平。為進一步明確NOD2在

8、心梗左室重構中的作用，采用NOD2敲基因小鼠建立心肌梗死模型，小動物超聲心動圖檢測心肌梗死的小鼠左心室內徑及心功能。通過Masson和Tunel染色觀察野生和NOD2-/-小鼠心梗后纖維化程度及細胞調亡情況，酶聯免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)測定組織的促炎細胞因子水平，心肌組織裂解液運用WesternBlot和明膠酶譜法檢測MMP9、MMP2蛋白及活性變化，并用免疫組化染色觀察心

9、梗后炎性細胞浸潤和心臟成纖維細胞（cardiacfibroblast，CF）轉分化成心肌成纖維細胞情況。體外實驗采用小鼠原代成纖維細胞探討NOD2參與心室重構的分子機制，運用WesternBlot等方法測定胞壁酰二肽（MuramylDipeptide，MDP）刺激成纖維細胞所產生的p38、細胞外信號調節(jié)激酶(Extracellularregulatedproteinkinases1/2，ERK1/2)磷酸化水平及成纖維細胞缺氧4h復氧不

10、同時間后NOD2和MMP9蛋白表達水平;ELISA檢測MDP刺激成纖維細胞及成纖維細胞轉染后缺氧4h復氧24h產生的炎性因子變化水平。
　　結果
　　第一部分:①NOD2隨著血漿Hcy濃度的升高蛋白表達增加，在CBS+/-模型組中表達最強，其次是WT模型組。免疫組化和PCR結果同樣證實，NOD2在CBS+/-模型組中的表達最強。②利用不同濃度的L-Hcy刺激大鼠心肌細胞H9C2，發(fā)現NOD2的表達成濃度依賴性上調，其中，L-

11、Hcy濃度在25μmol/L時，NOD2表達最強;不同濃度的L-Hcy刺激SMC，NOD2的表達同樣顯著上調。③心室重構標志物MMP9在WT模型中表達顯著升高，NOD2敲除后MMP9表達降低;COL1在WT模型中表達降低，而NOD2敲除后COL1表達升高。雖然NOD2能影響MMP9、COL1的蛋白表達，但是NOD2缺失未能減輕hHcys引起的心室重構。相比于WT對照組，WT模型組的左室舒張末期內徑(LVIDd)，左室收縮末期內徑(LVI

12、Ds)增大，說明左室肥大;左室舒張末期后壁厚度(LVPWd)和左室收縮末期后壁厚度(LVPWs)降低則表明左室壁變薄。而NOD2敲基因鼠高同型半胱氨酸血癥后的左室肥大和室壁變薄現象并沒有改變，說明NOD2基因敲出后未能減輕hHcys引起的心室重構。
　　第二部分:①首次證實，NOD2在心梗組織中表達升高。與假手術組相比，MI組非梗死區(qū)和梗死區(qū)NOD2mRNA表達水平明顯升高，其中梗死區(qū)NOD2的mRNA表達變化水平最高，而且呈時間

13、依賴性變化;WesternBlot和免疫組化結果同樣證實了心梗后NOD2表達升高。②NOD2缺失能減輕心梗后心肌功能失常和心肌重構的發(fā)生。通過超聲心動圖發(fā)現，NOD2-/-心梗組心功能損傷明顯改善;WT心梗后變化的左室直徑和室壁厚度在NOD2-/-敲基因鼠模型中也有所減輕，心肌重構減弱;TUNEL和Masson染色顯示在NOD2-/-心梗組，細胞凋亡和心肌纖維化程度明顯降低。③我們進一步發(fā)現，NOD2缺失能降低心梗區(qū)炎性因子水平，炎性細

14、胞的浸潤及MMP-9的活性。心梗發(fā)生后，TGF-β、白介素1β(interleukin，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TumorNecrosisFactor，TNF-α)、單核細胞趨化蛋白1(monocytechemoattractantprotein，MCP-1)等炎性因子水平顯著升高，而NOD2缺失能降低這些炎性因子的水平。小鼠心肌梗死后MMP9的蛋白和活性都升高，NOD2缺失后減弱了MI導致的MMP9蛋白和活性水平的提高。炎性細胞

15、浸潤在NOD2-/-心梗組中表達也顯著降低。④MDP誘導心肌成纖維細胞有絲分裂原激活蛋白激酶（Mitogenaetivatedproteinkinase，MAPK）信號通路的激活和促進促炎介質的產生。我們利用NOD2激活劑MDP刺激心肌成纖維細胞，發(fā)現P38、ERK-1/2等激酶的磷酸化水平增加;IL-1β、TNF-α、TGF-β、MCP-1、IL-8、細胞間黏附因子1(Intercellularadhesionmolecule，ICA

16、M-1)等促炎介質表達水平顯著升高。⑤NOD2沉默減弱缺氧誘導的MMP9表達。在原代培養(yǎng)的心肌成纖維細胞中，缺氧/復氧顯著增加NOD2和MMP9的表達，NOD2基因沉默后，缺氧誘導的MMP9表達和促炎介質的表達受到抑制。
　　結論
　　1.本文首次探討了NOD2在高同型半胱氨酸血癥(hHcys)導致心室重構中的作用，發(fā)現NOD2在CBS+/-造模的hHcys小鼠心肌組織中蛋白及mRNA水平顯著升高;利用NOD2敲基因鼠進一步

17、研究發(fā)現，NOD2缺失雖能降低心室重構標志物MMP9的表達，但對高同型半胱氨酸血癥誘導的心室重構沒有改善作用。分析原因一是高同型半胱氨酸血癥對心臟的損傷較小，只影響左室舒張內徑和左室后壁厚度而對心臟收縮及舒張功能沒有影響，因此NOD2缺失后的改善作用未能體現出來。二是NOD2敲除后可能衍生出別的代償機制從而影響高同型半胱氨酸血癥引起的心臟損傷，具體機制需進一步明確。
　　2.建立冠狀動脈左前降支結扎心肌梗死模型，研究NOD2是否參

18、與心肌梗死導致的心室重構過程。我們證實，在心肌梗死區(qū)和非梗死區(qū)NOD2mRNA表達水平明顯升高，其中梗死區(qū)NOD2的mRNA表達變化水平最高。利用NOD2敲基因鼠進一步研究發(fā)現，NOD2缺失能減輕心梗后心功能障礙和心肌重構的發(fā)生，細胞凋亡和心肌纖維化程度也明顯降低。研究表明，NOD2通過調控MMP9蛋白及活性、炎性介質水平和炎性細胞浸潤來介導心肌梗死后左室重構過程。體外采用小鼠心臟原代成纖維細胞，研究表明MDP誘導激活了心肌成纖維細胞M