小鼠侵襲性肺曲菌病NOD2表達(dá)及其在巨噬細(xì)胞抗曲菌免疫中的作用.pdf

1、目的:了解在免疫受損小鼠侵襲性肺曲菌病模型肺組織中NOD2表達(dá)的改變,并進(jìn)一步研究其NOD2在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7抗曲菌免疫中的作用。方法:(1)采用環(huán)磷酰胺腹腔注射的方法造成小鼠粒細(xì)胞缺乏,經(jīng)鼻滴入煙曲菌孢子,建立小鼠侵襲性肺曲菌病模型,檢測(cè)感染前后肺組織中NOD2和RIP2基因表達(dá)情況;(2)合成針對(duì)小鼠NOD2的三條siRNA序列及陰性對(duì)照序列,轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR方法及western blot方法

2、檢測(cè)基因沉默效果,篩選出有效序列;(3)以篩選出的有效siRNA序列轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,設(shè)置正常RAW264.7細(xì)胞做對(duì)照,分別以底液、MDP、Af、MDP+Af刺激兩組細(xì)胞,并觀察24h、48h、72h,收集細(xì)胞和上清,檢測(cè)NOD2和RIP2基因及其蛋白的表達(dá)情況、NF-κB蛋白表達(dá)情況和上清液TNF-α、IL-8的變化。
　　 結(jié)果:(1)免疫受損小鼠接種煙曲菌后肺部病理切片顯示明顯的充血、水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)并形成多

3、發(fā)病灶,六胺銀染色可見(jiàn)孢子生發(fā)成菌絲并呈多發(fā)集落分布,至18～48小時(shí)最為顯著,提示侵襲性肺曲菌病小鼠建模成功,而對(duì)照組炎癥反應(yīng)輕于免疫受損小鼠,未見(jiàn)到菌絲和孢子聚集的現(xiàn)象;(2)兩組小鼠在接種煙曲菌孢子后,肺組織中NOD2的mP～NA表達(dá)進(jìn)行性升高,與接種前有顯著差別(P＜0.05),至72小時(shí)達(dá)到觀察期間的最高峰,免疫受損組小鼠在接種后24h、48h高于正常組小鼠(P＜0.05):小鼠肺組織中RIP2基因的表達(dá)也呈進(jìn)行性升高,72小

4、時(shí)達(dá)高峰,與接種前比較有顯著差異(P＜0.05),但在不同時(shí)間點(diǎn),兩組小鼠之間RIP2無(wú)明顯差別;(3)設(shè)計(jì)并合成三條針對(duì)小鼠NOD2的siRNA,轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞中,24h后測(cè)定NOD2的mRNA和蛋白表達(dá)情況,與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列的細(xì)胞相比,序列3對(duì)NOD2 mRNA和蛋白表達(dá)的抑制率分別達(dá)到96％和80％(P＜0.05),達(dá)到預(yù)定的基因沉默效果;(4)RAW264.7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA序列后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí),

5、NOD2 mRNA表達(dá)都被顯著抑制(與對(duì)照組相比,P＜0.05);(5)以MDP刺激正常RAW264.7細(xì)胞,與僅加入等體積底液的對(duì)照組相比,NOD2 mRNA和蛋白的表達(dá)、RIP2 mRNA和蛋白的表達(dá)、NF-κB的蛋白表達(dá)以及細(xì)胞上清液中IL-8和TNF-α的含量均明顯增加(P＜0.05);以Af、MDP+Af刺激有相似的上調(diào)表現(xiàn)(P＜0.05),其中MDP+Af組升高最為顯著(P＜0.05);(6)經(jīng)siRNA序列3轉(zhuǎn)染的RAW2

6、64.7細(xì)胞,接受Af、MDP+Af刺激后,NOD2和RIP2的mRNA與不接受刺激的細(xì)胞相比升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),單純以MDP刺激,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與接受同樣刺激的正常RAW264.7細(xì)胞相比,NOD2和RIP2 mRNA的表達(dá)受到明顯抑制(P＜0.05):(7)經(jīng)RNA干擾的RAW264.7細(xì)胞,接受Af、MDP+Af刺激后,各時(shí)間點(diǎn),NF-κB蛋白的表達(dá)與未接受刺激的細(xì)胞相比,無(wú)明顯差別;(8)經(jīng)RNA干擾的RAW

7、264.7細(xì)胞,于各時(shí)間點(diǎn)TNF-α和IL-8的表達(dá)與正常的RAW264.7細(xì)胞相比明顯減少(P＜0.05);分別接受MDP、Af、Af+MDP刺激后,TNF-α和IL-8含量與不接受刺激的對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.05);接受相同干預(yù)后,RNA干擾細(xì)胞的TNF-α、IL-8含量在各時(shí)間點(diǎn)都少于正常組(P＜0.05)。結(jié)論:小鼠患侵襲性肺曲菌病后肺組織中NOD2和RIP2 mRNA升高,RAW264.7細(xì)胞經(jīng)MDP、曲菌孢子或MDP+