Th17細胞及其細胞因子在炎癥性腸病小鼠中的表達及作用機制探討.pdf

1、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是指病因尚不清楚的非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn'S disease，CD)，屬于自身免疫病。西方國家發(fā)病率一直很高，近年來國內報告日漸增多，累計超過12萬例次，已成為消化系統(tǒng)常見疾病和慢性腹瀉的主要病因。且多數(shù)患者反復發(fā)作，遷延不愈，甚至需要手術治療，不僅給患者帶來巨大痛苦，且有癌變風

2、險，因此研究IBD的發(fā)病機制并進而指導治療至關重要。但IBD的病因和發(fā)病機制尚未完全明確，已知腸道粘膜免疫系統(tǒng)異常反應所導致的炎癥反應在IBD發(fā)病中起重要作用。目前大多數(shù)研究者認為，該病的發(fā)病多與環(huán)境、遺傳、感染和免疫學因素有關，是一種多基因參與的作用于免疫系統(tǒng)和靶器官的疾病，而免疫學因素在其發(fā)病過程中起至關重要的作用。而在參與免疫炎癥過程的眾多因子和介質里尋找到一個關鍵因子將是我們研究的重點。
　　 動物模型是研究炎癥性腸病發(fā)

3、病機制的必要工具，目前可通過二種方法建立IBD模型。一種是通過基因敲除和轉基因方法建立模型，另一種是通過人工誘導建立模型。前者雖具有自發(fā)性的特點，但是技術要求高，對于實驗條件限制較大，費用也要求較高。后者方法成熟，易于操作。本實驗采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)灌腸免疫誘導BALB/C小鼠建立炎癥性腸病動物模型，該法誘導的小鼠腸炎組織學改變的特點與人類IBD相似，模型持續(xù)時間長，能體現(xiàn)急性炎癥向慢性轉化的動態(tài)過程，簡單易行，易于

4、復制。
　　 CD4+輔助T細胞在IBD發(fā)病中的作用已經得到公認，傳統(tǒng)的CD4+輔助性T細胞主要分為兩個亞群：Th1細胞亞群和Th2細胞亞群。Th17細胞亞群是近幾年才得到肯定的一類CD4+T細胞亞群，因其主要分泌IL-17而得名。既往關于IBD病因的研究中，多數(shù)學者認為其是由于Th1/Th2的失衡造成IBD發(fā)病，但是尚有許多問題無法解釋?，F(xiàn)已證明，在多種自身免疫性疾病患者及這些疾病的動物模型中IL-17表達均明顯升高，且其功能

5、狀態(tài)與多種自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關，因此Th17細胞很可能在自身免疫反應的發(fā)生和發(fā)展中起關鍵性作用。由此，我們推斷Th17細胞很可能與IBD發(fā)病密切相關，對其進行深入研究可能為我們尋找出IBD診斷的重要標志物和治療靶點。若Th17細胞在IBD發(fā)病中發(fā)揮關鍵作用，從而可以為治療IBD提供新的途徑。本項工作對于IBD的基礎研究和臨床診療都有重要意義。
　　 在IBD的發(fā)生過程中，細胞因子網絡的變化對疾病的發(fā)生和發(fā)展起到重要的作用

6、。一些促炎細胞因子在IBD患者中存在分泌水平的變化，提示這些促炎細胞因子參與了IBD的病理過程。本實驗通過觀察BALB/C小鼠IBD模型中的促炎細胞因子的變化和IL-17對其產生水平的影響，進一步探討Th17細胞在IBD發(fā)病中的作用機制。
　　 IBD患者存在免疫細胞凋亡異常，免疫細胞不正常凋亡可能是導致IBD發(fā)生的始動原因。因此本實驗通過觀察免疫后BALB/C小鼠脾單核細胞凋亡的變化和IL-17對其凋亡水平變化的影響，進一步研

7、究Th17細胞在炎癥性腸病發(fā)病中的作用機制。
　　 材料和方法：
　　 1、模型建立
　　 BALB/C小鼠，稱重編號后，隨機分為正常對照組和IBD模型組，正常對照組正常喂養(yǎng)。模型組參考文獻用TNBS溶液灌腸建立小鼠IBD模型，制造模型前給予禁食24h，予5％水合氯醛0.08ml腹腔注射麻醉，按1:1混合TNBS和50%乙醇溶液共0.2ml給予小鼠灌腸，灌腸后正常喂養(yǎng)。處死小鼠后取病變較重部位結腸組織，還分別取外

8、周血，脾臟及腸系膜淋巴結。
　　 2、外周血單核細胞的制備小鼠經眼球取血，將血置于抗凝管中，經Ficoll-Hypaque分離液密度梯度離心，得到外周血單核細胞(PBMC)。
　　 3、脾單核細胞的制備小鼠脾臟細胞懸液，經Ficoll-Hypaque分離液密度梯度離心，得到脾單核細胞(SMC)。
　　 4、脾單核細胞的培養(yǎng)把灌腸后3天處死小鼠所需培養(yǎng)的SMC分為3組，每組含SMC1×106/ml，將三組細胞置于R

9、PMI-1640培養(yǎng)液中并分別加入1 u g/ml抗IL-17抗體，10ug/ml抗IL-17抗體，等量PBS。正常對照組小鼠取1×106/mlSMC亦置于RPMI-1640培養(yǎng)液中并加入等量PBS，四組細胞均置于37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h后取出。
　　 5、ELISA法檢測結腸組織IL-17和IFN-γ
　　 組織勻漿離心取上清液，嚴格按照試劑盒說明操作，終止反應后在450nm處讀取各孔吸光度值以各孔OD值為縱坐

10、標，以標準品的濃度為橫坐標繪制標準曲線，根據(jù)樣品OD值查找對應的濃度。
　　 6、Western blot法檢測IL-17蛋白水平的變化用Western blot法檢測正常對照組和模型組3天處死小鼠血單核細胞，脾單核細胞，腸系膜淋巴結細胞及結腸組織IL-17蛋白水平的變化。先將各組細胞及組織提取總蛋白，紫外分光光度計法進行蛋白定量后進行SDS-PAGE，電泳后轉至PVDF膜，室溫封閉2小時，加入一抗1:800兔抗鼠IL-17抗體

11、，4℃孵育過夜，PBS洗膜，加入二抗1:1000羊抗兔IgG/HRP，室溫孵育2小時，沈膜3次，化學發(fā)光試劑反應5分鐘，曝光、顯影。
　　 7、逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定各組脾單核細胞IFN-γ，TNF-a，IL-6mRNA表達按照試劑盒說明書操作提取細胞總RNA，用紫外分光光度計測定樣品，以確定RNA的質量并計算濃度。將RNA進行逆轉錄反應合成cDNA用于PCR擴增。b-actin為內參照，上游引物為GAATAC

12、TCTATTGCCGATGGT，下游引物為CGATGGGTTTGCGTTTG，擴增長度為722bp。TNF-a上游引物為TTACGCCTTTGAAGTTAGCAG，下游引物為CGTCCAAATACATCGCAAC，擴增長度為498bp。IL-6上游為ACAACGGGTGGAACATTACC，下游引物為TGGGTTTGCGTTTGTGAG，擴增長度為422bp。IFN-γ上游引物為ACCCTCCTGGTTATTGAGCC，下游引物為TGG

13、TAATGTTCCACCCGTTG，擴增長度為288bp。擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，經紫外凝膠成像分析系統(tǒng)分析，根據(jù)目的基因條帶吸光度和內參特異性條帶的吸光度比值作為目的基因的相對表達量。
　　 8、用流式細胞儀檢測脾單核細胞培養(yǎng)液中加入抗IL-17抗體后，脾單核細胞凋亡的變化把脾單核細胞離心后5分鐘，用200ul Binding Buffer重懸細胞后再離心5分鐘，加入10ul AnneexinV-FITC和5u

14、lPI，再加入300ulBinding Buffer，1h內流式細胞儀上機檢測。
　　 結果：
　　 1、用TNBS灌腸可以成功誘導BALB/C小鼠結腸炎模型2、ELISA實驗結果小鼠灌腸后ELISA法檢測IL-17和IFN-γ在結腸組織中的表達。其中IL-17在灌腸后1天就明顯增高，灌腸后3天達到高峰后開始下降，灌腸后14天和21天組與對照組比較無明顯差異。IFN-γ在灌腸后1天無明顯增高，后緩慢升高，至灌腸后3天才有

15、顯著增高，灌腸后7天達到高峰后開始下降，灌腸后14，21天與對照組比較仍有顯著差異。以上結果提示在TNBS誘導的結腸炎中IL-17的作用早于IFN-γ的作用。IL-17在灌腸后3天時表達最高，因此把灌腸后3天小鼠作為進一步研究對象。
　　 3、Western blot檢測不同組織IL-17蛋白水平Western blot檢測正常對照組和模型3天組小鼠血單核細胞，脾單核細胞，腸系膜淋巴結細胞及結腸組織IL-17蛋白水平的變化，其中

16、模型組脾單核細胞，腸系膜淋巴結細胞，結腸組織IL-17均較正常對照組明顯增高，尤其以結腸組織升高明顯。模型組血單核細胞IL-17與對照組相比無明顯差異。
　　 4、RT-PCR檢測 TNF-a、IFN-γ、IL-6mRNA表達模型組3天小鼠脾單核細胞分別加入PBS、1 ug/ml抗IL-17抗體、10 ug/ml抗IL-17抗體和正常對照組脾單核細胞加入PBS，四組細胞培養(yǎng)24h后用RT-PCR法檢測TNF-a、IFN-γ、IL

17、-6mRNA的表達。其中模型組中的PBS組TNF-a、IFN-γ、IL-6與正常對照的PBS組比較差異顯著。模型組中的1 ug組TNF-a、IL-6與模型組中的PBS組比較有所下降但無差異，而模型組中的1ug組IFN-γ與模型組中的PBS組比較亦無顯著性差異。模型組中的10ug組TNF-a、IL-6與模型組中的PBS組比較差異顯著，而模型組中的10ug組IFN-γ與模型組中的PBS組比較無顯著性差異。
　　 5、流式細胞儀檢測脾

18、單核細胞凋亡模型組脾單核細胞分別加入PBS、1 ug/ml抗IL-17抗體、10 ug/ml抗IL-17抗體和正常對照組脾單核細胞加入PBS，四組細胞培養(yǎng)24h后用流式細胞儀檢測細胞的凋亡。模型組中和PBS共同培養(yǎng)的脾單核細胞與正常對照組和PBS共同培養(yǎng)的脾單核細胞相比，凋亡比例明顯減少(p<0.05)，模型組中和1ug/ml抗IL-17抗體共同培養(yǎng)的脾單核細胞與模型組中和PBS共同培養(yǎng)的脾單核細胞相比，凋亡比例有所增加但不明顯。模型組

19、中和10ug/ml抗IL-17抗體共同培養(yǎng)的脾單核細胞與模型組中和PBS共同培養(yǎng)的脾單核細胞相比，凋亡比例明顯增多結論：
　　 1、用TNBS灌腸可以成功誘導BALB/C小鼠結腸炎模型2、Th17細胞具有組織器官的特異性及靶向性3、Th17細胞在IBD發(fā)病的早期階段起關鍵性作用，Th1細胞在維持炎癥的持續(xù)中發(fā)揮作用4、在IBD發(fā)病過程中Th17細胞和Th1細胞起到協(xié)同作用5、Th17細胞可通過促進下游細胞因子產生促進IBD的發(fā)生