人呼吸道上皮細(xì)胞Nod2受體的表達(dá)與調(diào)控—Nods受體在天然免疫中作用的初探.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)近年來(lái)頗受關(guān)注，它是生物體賴以生存的最基本條件，是抵御微生物入侵的第一道屏障，是生物體在長(zhǎng)期種系發(fā)生和進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成的，對(duì)各種病原微生物都具有抗感染的作用。與獲得性免疫系統(tǒng)一起組成了人體抵御外界的兩大重要防御機(jī)制。 天然免疫識(shí)別的是微生物生存所必需的，相對(duì)保守的，并且宿主不具備的病原體相關(guān)模式分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），包括革蘭陰性菌的脂多糖（L

2、PS）、革蘭陽(yáng)性菌的磷壁酸、病毒的雙鏈RNA、細(xì)菌的非甲基化CpGDNA、細(xì)菌的蛋白特征分子甲酰甲硫氨酰肽等。而天然免疫系統(tǒng)的受體則稱為模式分子識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）。識(shí)別受體是在種系發(fā)生中產(chǎn)生，是長(zhǎng)期自然選擇的結(jié)果。目前研究較多的兩種主要的受體分別為T(mén)oll受體與Nods蛋白受體。經(jīng)研究表明Nods蛋白受體，主要是Nod1和Nod2，分布在腸道等上皮細(xì)胞胞漿中，能識(shí)別細(xì)菌胞壁肽

3、聚糖成分，能被細(xì)胞因子及侵襲性細(xì)菌上調(diào)表達(dá)，激活NF-K B信號(hào)途徑，啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。 本項(xiàng)研究的目的是檢測(cè)呼吸道上皮細(xì)胞和膀胱上皮細(xì)胞中有無(wú)Nod2的表達(dá)，并進(jìn)一步探討其表達(dá)的調(diào)控因素以及其胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 首先，我們研究了呼吸道上皮細(xì)胞A549和膀胱上皮細(xì)胞T24中有無(wú)Nod2的表達(dá)，并研究了細(xì)胞因子，活菌對(duì)Nod2的表達(dá)有無(wú)影響。常規(guī)培養(yǎng)呼吸道上皮細(xì)胞株A549和膀胱上皮細(xì)胞株T24，用細(xì)胞因子TN

4、F-a，以一定的濃度，刺激A549或者T24細(xì)胞6小時(shí)，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照Genbank上的Nod2序列，設(shè)計(jì)跨越內(nèi)含子的引物，并以GAPDH為內(nèi)參照，做半定量：PCR，檢測(cè)細(xì)胞中Nod2的表達(dá)及其表達(dá)是否受細(xì)胞因子的影響。結(jié)果表明，A549和T24細(xì)胞中均有Nod2的基礎(chǔ)表達(dá)，但是表達(dá)量較低，用細(xì)胞因子刺激后表達(dá)量明顯增強(qiáng)。 TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)銅綠假單胞菌：PAO1及ATCC 27853，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)肺炎

5、克雷伯桿菌KP03183，收集細(xì)菌，紫外分光光度計(jì)于650nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，確定細(xì)菌濃度。按一定的比例，活菌作用于細(xì)胞，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，擴(kuò)增Nod2片段，并以GAPDH為內(nèi)參照，做半定量PCR，檢測(cè)細(xì)胞中Nod2的表達(dá)是否受活菌刺激的影響。由于活菌中的成分不如細(xì)胞因子那樣高純度，且活菌涉及的影響因素（如細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)菌活力等）較多，我們?cè)O(shè)計(jì)了在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察Nod2表達(dá)的變化。結(jié)果表明，銅綠假單

6、胞菌PA01i在刺激6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)都較未刺激組表達(dá)量有明顯增加。而銅綠假單胞菌ATCC 27853在刺激12小時(shí)比未刺激組表達(dá)量有增加。KP03183刺激T24細(xì)胞在6小時(shí)增加較為明顯。提示細(xì)菌活菌能夠刺激上皮細(xì)胞Nod2表達(dá)的增加，并且隨菌種、時(shí)間和濃度的變化，增加的強(qiáng)度有所不同。 我們進(jìn)一步探討了Nod2介導(dǎo)的天然免疫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否與NF．κB信號(hào)通路有關(guān)。按照Genbank上有關(guān)的Nod2DNA序列，參考相

7、關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出含有NF-κ B結(jié)合序列的Nod2上游調(diào)控序列。重組到報(bào)告基因載體上，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性，判斷刺激因素是否能夠激活Nod2上游調(diào)控序列中的NF-κ B結(jié)合序列。采用細(xì)胞因子TNF-a，IFN-γ，IL-1β，以一定的濃度或者濃度梯度，作用于轉(zhuǎn)染過(guò)重組報(bào)告基因質(zhì)粒的A549細(xì)胞，刺激6小時(shí)，裂解細(xì)胞，裂解液測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果提示細(xì)胞因子刺激后熒光素酶活性顯著增加，并顯示出了TNF-α和TFN-γ的協(xié)同作用。以銅綠假單

8、胞菌（PAO1）活菌刺激細(xì)胞，檢測(cè)出的熒光素酶活性表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，在12小時(shí)增加較為明顯。銅綠假單胞菌培養(yǎng)上清刺激細(xì)胞，高濃度時(shí)熒光素酶活性增加較為明顯。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示細(xì)胞因子和銅綠假單胞菌（PAO1）活菌能夠刺激上皮細(xì)胞中Nod2的表達(dá)，并且可能是通過(guò)激活NF-кB誘導(dǎo)其表達(dá)升高。 上述研究結(jié)果提示，上皮細(xì)胞可能通過(guò)Nod2蛋白受體感受外來(lái)刺激，如細(xì)胞因子和細(xì)菌活菌等等，激活轉(zhuǎn)錄因子NF－кB，啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)