腺苷及其受體在心血管組織工程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、近幾年，心血管疾病的發(fā)病率以及死亡率逐年升高，臨床上對(duì)于直徑小于6 mm的組織工程血管需求量很高。以腺苷及其受體為研究工具，從五個(gè)方面深入研究局部微環(huán)境的優(yōu)化對(duì)組織工程血管長(zhǎng)期通暢的影響。
　　一、腺苷通過(guò)調(diào)控細(xì)胞能量代謝優(yōu)化組織工程血管微環(huán)境
　　證明了腺苷可以通過(guò)能量轉(zhuǎn)換促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢，實(shí)現(xiàn)組織工程血管的早期快速內(nèi)皮化。歸巢的內(nèi)皮祖細(xì)胞在腺苷的作用下，可以分泌VEGF、SDF-1和MMP-9等血管生成因子，進(jìn)

2、一步促進(jìn)周圍內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。此外，腺苷還可以通過(guò)細(xì)胞保護(hù)、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和抑制平滑肌增殖等機(jī)制優(yōu)化組織工程血管移植后的局部微環(huán)境，最終促進(jìn)血管移植物的長(zhǎng)期通暢。為了解決腺苷在循環(huán)系統(tǒng)中半衰期極短的問(wèn)題，我們制作了負(fù)載有腺苷的β-環(huán)糊精/殼聚糖納米緩釋顆粒，并通過(guò)層層組裝的方式構(gòu)建了腺苷修飾的組織工程血管。組織工程血管內(nèi)表面涂層的腺苷分子能夠快速的被釋放，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢，實(shí)現(xiàn)工程血管的快速內(nèi)皮化，而負(fù)載有腺苷的β-環(huán)糊精/

3、殼聚糖納米緩釋顆粒會(huì)緩慢地在局部釋放腺苷，長(zhǎng)時(shí)程優(yōu)化移植的組織工程血管局部微環(huán)境，維持血管的持續(xù)通暢。
　　二、腺苷受體調(diào)控單核/巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞之間的Crosstalk
　　腺苷發(fā)揮生物學(xué)功能主要通過(guò)兩個(gè)途徑:直接進(jìn)入細(xì)胞作為ATP生成的底物參與細(xì)胞能量代謝;與細(xì)胞表面的腺苷受體相結(jié)合，激活其下游的信號(hào)通路。適度調(diào)控移植后的炎癥反應(yīng)可能會(huì)成為維持組織工程血管通暢的一個(gè)有效的途徑。腺苷A2a受體在單核/巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)

4、胞表面均高表達(dá)，且具有促血管生成和炎癥調(diào)控等功能，因此我們將腺苷A2a受體作為一個(gè)工具，研究腺苷受體激活對(duì)組織工程血管通暢的影響。我們首先制備了羥丙級(jí)-β-環(huán)糊精/殼聚糖納米顆粒來(lái)控制腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680釋放和增加其水溶性，并采用層層組裝的方式構(gòu)建CGS21680修飾的組織工程血管，其可以控制藥物在一個(gè)月內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定釋放。移植6個(gè)月后，CGS21680修飾的組織工程血管仍維持通暢，內(nèi)皮化良好。我們進(jìn)一步檢測(cè)移植后不同時(shí)間段

5、組織工程血管內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞核型的轉(zhuǎn)換，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后第3天相對(duì)于CGS21680組，對(duì)照組移植后M1型單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著升高，并隨著時(shí)間的累積進(jìn)一步提升;而對(duì)照組M2型單核/巨噬細(xì)胞的數(shù)量要明顯的低于CGS21680組。體外的結(jié)果顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞在炎性刺激下顯著表達(dá)E-selectin，促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞核型向M1型的極化。腺苷A2a受體激活直接通過(guò)COX-2通路促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞向M2型的極化和分泌更多的VEGF、IL-10等促血

6、管生成因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移和動(dòng)員;同時(shí)還可以通過(guò)降低內(nèi)皮祖細(xì)胞表面促炎分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表達(dá)，抑制單核/巨噬細(xì)胞向M1型的極化。綜上，我們的研究第一次證明了歸巢的內(nèi)皮祖細(xì)胞在炎癥刺激下，可以促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞向M1型極化，加劇組織工程血管局部的炎癥反應(yīng);腺苷A2a受體的激活可以通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞之間的Crosstalk，誘導(dǎo)移植產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)向促進(jìn)血管化的趨勢(shì)發(fā)展，最終促進(jìn)組織工程

7、血管的通暢。
　　三、內(nèi)源性腺苷維持組織工程血管長(zhǎng)期通暢的作用研究
　　研究?jī)?nèi)源性腺苷對(duì)組織工程血管長(zhǎng)期通暢的影響能為構(gòu)建內(nèi)源性腺苷持續(xù)穩(wěn)定釋放的組織工程血管提供理論基礎(chǔ)?？紫堵屎涂讖酱笮∨c組織工程材料內(nèi)的細(xì)胞的存活、增殖和分化緊密相關(guān)。大的孔徑和相互連通的網(wǎng)絡(luò)有利于材料內(nèi)細(xì)胞與外界進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)和氧氣的交換，有文獻(xiàn)報(bào)道維持材料內(nèi)部血管與外界進(jìn)行充足的氧氣和物質(zhì)交換的最小孔徑大約為30到40 um。然而較大的孔隙率和孔徑降低了生物

8、材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。組織工程血管移植后需要經(jīng)受血液很大的流體剪切力和沖刷力，不穩(wěn)定的材料結(jié)構(gòu)容易引起組織工程血管堵塞、變形甚至破裂。有人認(rèn)為組織工程血管內(nèi)層的孔徑應(yīng)該小于24um，這低于維持物質(zhì)交換所需的最小孔徑。因此組織工程血管局部的微環(huán)境在外層毛細(xì)血管長(zhǎng)入前是一個(gè)嚴(yán)重缺氧和營(yíng)養(yǎng)匱乏的微環(huán)境，不利于浸潤(rùn)的單核/巨噬細(xì)胞的生存。磷酸鹽濃度的升高與心血管疾病的發(fā)生緊密相關(guān)，此外磷酸鹽濃度的升高還可以提高細(xì)胞的能量代謝，增加ATP的生成，這進(jìn)

9、一步加重了移植材料內(nèi)部缺血缺氧環(huán)境下細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，加劇了細(xì)胞的損傷和死亡。Klotho蛋白是一種抗細(xì)胞衰老蛋白，與鈣磷代謝和能量代謝均緊密相關(guān)，這提示了Klotho蛋白可能具有促進(jìn)內(nèi)源性腺苷釋放來(lái)發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)的功能。我們的結(jié)果顯示Klotho蛋白能改變生物材料內(nèi)浸潤(rùn)的單核/巨噬細(xì)胞對(duì)胞外高磷的應(yīng)答模式，降低能量代謝水平，維持細(xì)胞的存活和降低細(xì)胞凋亡。同時(shí)能量代謝的降低使細(xì)胞內(nèi)ATP大量降解，釋放大量的內(nèi)源性腺苷。流式檢測(cè)的結(jié)果顯示外周

10、血增多的腺苷可以打破骨髓中干細(xì)胞的靜息狀態(tài)，提高其能量代謝水平，促進(jìn)更多的內(nèi)皮祖細(xì)胞向外周血?jiǎng)訂T和向單核/巨噬細(xì)胞遷移。鐵絲損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Klotho蛋白可以促進(jìn)血液中增多的內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢到損傷的部位，通過(guò)分化形成內(nèi)皮細(xì)胞和旁分泌作用促進(jìn)組織工程血管的快速內(nèi)皮化。因此我們采用β-環(huán)糊精/殼聚糖納米顆粒和層層組裝的方式構(gòu)建了Klotho蛋白修飾的組織工程血管，這種血管可以控制Klotho蛋白穩(wěn)定釋放超過(guò)一個(gè)月。移植六個(gè)月后，Klotho

11、蛋白修飾的組織工程血管的通暢率達(dá)到了90％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)的高于對(duì)照組。染色和掃描電鏡的結(jié)果顯示其內(nèi)皮化程度良好，無(wú)明顯的內(nèi)膜增生和血栓形成。綜上，我們的結(jié)果證明了Klotho蛋白具有將無(wú)機(jī)磷增加的信號(hào)通過(guò)調(diào)控能量代謝的方式最終轉(zhuǎn)換為內(nèi)源性腺苷的功能，內(nèi)源性腺苷釋放的增加可以通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員和優(yōu)化局部微環(huán)境維持組織工程血管的長(zhǎng)期通暢。
　　四、腺苷在糖尿病疾病狀態(tài)下保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞的機(jī)制研究
　　研究糖尿病條件下微環(huán)境優(yōu)化和干細(xì)胞

12、保護(hù)對(duì)于構(gòu)建抗高糖損傷的組織工程血管具有十分重要的意義。自噬是機(jī)體內(nèi)一個(gè)重要的生理現(xiàn)象，可以將代謝廢物轉(zhuǎn)化為氨基酸等細(xì)胞進(jìn)行三羧酸循環(huán)所必須的原料，加速細(xì)胞代謝廢物清除。我們的研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病患者體內(nèi)，內(nèi)皮祖細(xì)胞的自噬水平顯著下降，而能量代謝的水平則顯著升高，自噬與能量代謝穩(wěn)態(tài)失衡最終引起內(nèi)皮祖細(xì)胞促血管生成功能受損，甚至死亡。腺苷通過(guò)增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的自噬水平，維持自噬與能量代謝穩(wěn)態(tài)的平衡，保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞免受高糖的損傷和促進(jìn)其向內(nèi)皮細(xì)胞

13、分化。為了在體驗(yàn)證腺苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的保護(hù)作用，我們選擇了糖尿病潰瘍作為動(dòng)物驗(yàn)證模型。內(nèi)皮祖細(xì)胞在受腺苷刺激后種植到提前制備好的可降解生物材料上，培養(yǎng)48小時(shí)后移植到糖尿病潰瘍的表面。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腺苷顯著增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞-生物材料對(duì)糖尿病潰瘍愈合的治療作用，其機(jī)制是腺苷通過(guò)自噬保護(hù)移植內(nèi)皮祖細(xì)胞促血管生成功能和促進(jìn)其分化。綜上我們的研究發(fā)現(xiàn)腺苷可以作為抗高糖損傷組織工程血管的一個(gè)構(gòu)建靶點(diǎn)，來(lái)發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)和促血管生成的功能。
　　五、抗高糖

14、損傷組織工程血管的構(gòu)建
　　腺苷具有內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員歸巢、干細(xì)胞保護(hù)和微環(huán)境優(yōu)化等生物學(xué)功能，然而將其直接應(yīng)用于糖尿病的血管替代治療效果卻很不理想，目前還未見(jiàn)可用于糖尿病血管替代的組織工程血管的成功報(bào)道。究其原因，主要是由于糖尿病外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移、旁分泌和分化等促血管生成的功能受到了嚴(yán)重的損害，歸巢到組織工程血管內(nèi)表面不能促進(jìn)血管的快速內(nèi)皮化;同時(shí)糖尿病體內(nèi)高糖和氧化應(yīng)激的微環(huán)境加劇了組織工程血管移植后的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)歸

15、巢的干細(xì)胞造成了進(jìn)一步的損傷。適合糖尿病的組織工程血管理想涂層藥物至少需要同時(shí)具備干細(xì)胞捕獲、恢復(fù)受損的干細(xì)胞功能、抵御高糖損傷和優(yōu)化局部微環(huán)境四個(gè)功能。腺苷激酶(ADK)是一種催化腺苷生成ATP的核苷激酶，研究表明腺苷激酶表達(dá)上調(diào)會(huì)加速缺血條件下細(xì)胞的損傷和死亡，而腺苷激酶抑制有助于維持組織損傷狀態(tài)下細(xì)胞能量代謝的維持，抵御疾病的損傷。同時(shí)腺苷激酶抑制的細(xì)胞可以持續(xù)的釋放腺苷，腺苷是一種局部微環(huán)境的優(yōu)化分子，具有調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞保護(hù)

16、和促進(jìn)血管生成等作用。這些都說(shuō)明了腺苷激酶可以作為糖尿病狀態(tài)下干細(xì)胞基因調(diào)控作用靶點(diǎn)的可能性。因此，我們構(gòu)建了CD133/ADK嵌合體修飾的組織工程血管血管，其在糖尿病大鼠體內(nèi)移植30天后依舊維持通暢，沒(méi)有顯著的內(nèi)膜增生和血栓形成。我們的組織工程血管由組織工程血管支架和CD133/ADK嵌合體兩個(gè)部分構(gòu)成，移植前兩個(gè)部分混合可以自組裝形成穩(wěn)定的RNA修飾的組織工程血管。我們準(zhǔn)備了聚醚酰亞胺(PEI)/金納米顆粒，顆粒大小約為200nm。

17、制備過(guò)程中四氯合金酸(HAuCl4)的升高，降低了PEI/金納米顆粒的轉(zhuǎn)染能力，進(jìn)而來(lái)減少RNA轉(zhuǎn)染的非特異性;同時(shí)還增加組織工程血管的穩(wěn)定性和生物相容性，更能抵抗循環(huán)系統(tǒng)的剪切和沖刷。CD133/ADK嵌合體由CD133適配體RNA和ADK SiRNA構(gòu)成，CD133適配體特異性的捕獲循環(huán)中的CD133陽(yáng)性細(xì)胞。捕獲的細(xì)胞能內(nèi)吞結(jié)合的嵌合體，在細(xì)胞內(nèi)Dicer酶的特異性剪切下形成ADK SiRNA，改善CD133陽(yáng)性細(xì)胞受損的促血管生