多巴胺D3受體對腎臟近曲小管上皮細(xì)胞D4受體的影響在原發(fā)性高血壓發(fā)病中的作用.pdf

1、一、研究背景：
　　 腎臟在人體血壓調(diào)控中起著重要的作用，它主要通過腎小管，尤其腎近曲小管（renAlproximAltubule, RPT）對尿鈉的排泄作用而發(fā)揮對血壓的調(diào)節(jié)作用。在腎臟，腎近曲小管可調(diào)控超濾液中約70％的水鈉及100％的葡萄糖和氨基酸。
　　 腎臟多巴胺受體在促進(jìn)尿鈉排泄方面發(fā)揮重要作用,多巴胺受體按其結(jié)構(gòu)和藥理特性不同分為兩大類，即D1類受體(D1、D5)和D2類受體(D2、D3、D4),所有多巴胺

2、受體都直接或間接參與腎臟的尿鈉排泄和血壓的調(diào)控。D3、D4受體同為D2類受體，均在腎近曲和遠(yuǎn)端集合管表達(dá)豐富。有研究結(jié)果表明：D3受體基因敲除小鼠血壓升高,伴有尿鈉排泄能力下降，刺激D3受體可舒張血管，促進(jìn)鈉排泄，腎動脈灌注D3受體特異性激動劑PD128907可使高鹽飲食WKY(Wistar-Kyoto)大鼠尿鈉排泄增加，且呈劑量依賴性,然而這種作用在自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SH

3、Rs)喪失。我們前期研究表明在腎近曲小管上皮細(xì)胞，刺激D3受體可增加D1類受體的表達(dá)，并可增強D1類受體對Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用；相反，刺激D3受體抑制血管緊張素ⅡⅠ型受體（angiotensin Ⅱtype Ⅰreceptor, AT1）蛋白和mRNA的表達(dá)。D4受體表達(dá)于腎集合管、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管，以集合管最為豐富。有研究表明D4受體在集合管有拮抗抗利尿激素和醛固酮所介導(dǎo)的水鈉轉(zhuǎn)運的作用。在腎近曲小管，刺激D4抑制N

4、a+-K+-ATPase活性及降低AT1的表達(dá)，D4-/-小鼠收縮壓、舒張壓高于D4+/+小鼠，AT1受體表達(dá)增加，提示：D4受體除直接抑制Na+-K+-ATPase活性外，還可能通過抑制AT1受體表達(dá)，間接發(fā)揮調(diào)節(jié)血壓的作用。
　　 既往研究表明：多巴胺各亞型之間（如：D3受體與D1受體）以及多巴胺系統(tǒng)與其他血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)具有相互作用，如：D3與AT1受體、D1與AT1受體，因此我們推測：同為D2類受體的D3受體與D4受體之間也

5、存在相互作用的可能。如果存在相互作用，那么它是通過何種途徑實現(xiàn)？這種相互作用的信號分子機制是什么？在高血壓的發(fā)生、發(fā)展中又扮演了什么樣的角色？因此本實驗通過研究WKY及SHR的RPT上皮細(xì)胞D3受體對D4受體的影響及分子信號機制，并探討這種影響在原發(fā)性高血壓發(fā)生中的作用。
　　 二、研究目的：
　　 研究WKY和SHR大鼠的RPT上皮細(xì)胞多巴胺D3 受體對D4 受體的影響及機制，探討這種影響在高血壓發(fā)病中作用。
　

6、　 三、研究方法：
　　 1、以WKY和SHR RPT上皮細(xì)胞株為研究對象，通過免疫印跡法明確刺激D3受體后D4受體蛋白表達(dá)的變化。
　　 2、用RT-PCR方法檢測D3受體后激動后D4受體mRNA的變化，并比較在WKY和SHR大鼠的RPT細(xì)胞中的差別。
　　 3、用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)及免疫共沉淀明確D3受體和D4受體是否存在共存現(xiàn)象及物理連接。
　　 4、以WKY和SHR腎小管上細(xì)胞株為研究對象，用

7、Na+-K+-ATP酶的活性檢測法測定D4受體激動劑PD168077刺激細(xì)胞后Na+-K+-ATP酶的活性的變化，并測定在D3激動劑預(yù)先刺激細(xì)胞后，再用D4受體激動劑PD168077刺激細(xì)胞后Na+-K+-ATP酶的活性的變化，比較該影響在WKY RPT細(xì)胞和SHR RPT細(xì)胞之間的區(qū)別。
　　 5、以WKY和SHR腎小管上細(xì)胞株為研究對象，在預(yù)先阻斷磷脂酶C(PLC)、三磷酸肌醇(IP3)、蛋白激酶C(PKC)情況下，用免疫印

8、跡法觀察D3受體對D4受體蛋白表達(dá)影響的變化，深入探討D3受體對D4受體影響的可能分子機制。
　　 6、比較WKY和SHR腎小管上皮細(xì)胞D3對D4受體影響的區(qū)別，進(jìn)一步探討其在高血病發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.刺激D3受體增加WKY大鼠RPT上皮細(xì)胞D4受體蛋白的表達(dá)，但抑制SHR大鼠D4受體蛋白的表達(dá),這種作用呈現(xiàn)一定的濃度、時間依賴性。
　　 2.無論在WKY還是SHR腎小管上皮細(xì)

9、胞中，D3受體與D4受體均存在共存現(xiàn)象，但共存現(xiàn)象在SHR腎小管上皮細(xì)胞中明顯比WKY腎小管上皮細(xì)胞中減弱。免疫共沉淀結(jié)果顯示：D3受體與D4受體在WKY和SHR腎小管上皮細(xì)胞中存在物理連接，D3受體刺激后在WKY細(xì)胞中D3受體與D4受體物理連接加強，而在SHR中卻出現(xiàn)物理連接減弱現(xiàn)象。
　　 3.用D4受體激動劑168077(10-7M/15min)刺激細(xì)胞可明顯降低WKY大鼠RPT細(xì)胞的Na+-K+-ATP酶的活性。預(yù)先用D

10、3受體激動劑刺激(PD128907，10-7M/24h)，再用D4受體激動劑168077(10-7M/15min)刺激細(xì)胞后Na+-K+-ATP酶的活性進(jìn)一步降低，但在SHR的RPT細(xì)胞，這種強化抑制作用喪失。
　　 4.D3受體激動劑(PD128907，10-7M/24h)刺激RPT上皮細(xì)胞，D4受體表達(dá)增強，但在分別預(yù)先阻斷磷脂酶C(PLC)、三磷酸肌醇(IP3)、蛋白激酶C(PKC)后，D4受體表達(dá)增強作用消失。