IL-1β對(duì)人腎近曲小管上皮細(xì)胞ABCG2表達(dá)影響的研究.pdf

1、痛風(fēng)(gout)是一種單鈉尿酸鹽(monosodium urate，MSU)沉積所致的晶體相關(guān)性關(guān)節(jié)病，與嘌呤代謝紊亂及（或）尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關(guān)。痛風(fēng)患者較以前有明顯增多，血清尿酸水平與心血管疾病、高血壓、2型糖尿病、血脂異常和慢性腎病等有關(guān)，因此需要引起人們的重視。
　　在哺乳動(dòng)物中，近曲小管是腎處理尿酸的主要部位。尿酸在腎小管的重吸收和分泌是由不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)完成的。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2(ATP-bin

2、dingcassette superfamilyGmember2，ABCG2)基因編碼的蛋白是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的一個(gè)促腎小管上皮細(xì)胞排泌尿酸通道。ABCG2位點(diǎn)與血清尿酸水平和痛風(fēng)危險(xiǎn)度有關(guān)。近來(lái)，ABCG2基因與高尿酸血癥及痛風(fēng)的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)。在臨床上我們發(fā)現(xiàn)，部分痛風(fēng)病人在急性發(fā)作期的尿酸水平反而降低。我們推測(cè)，痛風(fēng)急性發(fā)作時(shí)，ABCG2功能增強(qiáng)，尿酸排泄增加，從而表現(xiàn)為血清尿酸水平降低，當(dāng)這種反饋機(jī)制效能降低，患者尿酸

3、水平上升。
　　白介素(IL)-1β是痛風(fēng)中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)促炎因子，已有多項(xiàng)IL-1β在不同細(xì)胞內(nèi)影響ABCG2表達(dá)的研究，但目前尚未見IL-1β對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)ABCG2影響的報(bào)道。
　　目的:本研究旨在觀察在IL-1β刺激下的人腎近曲小管上皮細(xì)胞的ABCG2mRNA與蛋白表達(dá)水平、蛋白亞細(xì)胞定位，探求調(diào)控的信號(hào)通路。
　　方法:
　　1.利用免疫熒光在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)ABCG2的表達(dá)情況和蛋白亞細(xì)

4、胞定位。
　　2.分別用不同濃度(0、0.1、1、5、10ng/ml)的IL-1β刺激人腎近曲小管上皮(HK-2)細(xì)胞24小時(shí)，以及用1ng/ml的IL-1β刺激HK-2細(xì)胞不同時(shí)間(0、1、2、4、8、16、24、48h)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR)檢測(cè)ABCG2的mRNA表達(dá)水平，利用Western blot觀察其蛋白表達(dá)量。
　　3.用10ng/ml IL-1β、10ng/mlIL-10、

5、10ng/ml TGF-β、25ng/mlTNF-α、10ng/mlIL-1β聯(lián)合10ng/ml IL-10、10ng/mlIL-1β聯(lián)合10ng/ml TGF-β及10ng/mlIL-1β聯(lián)合25ng/ml TNF-α處理HK-2細(xì)胞24小時(shí)后提取蛋白，以及在加入10ng/ml IL-1β1小時(shí)后分別用信號(hào)通路抑制劑（10uM JNK抑制劑Sp600125、5uMERK抑制劑U-0126、100uM NF-κB抑制劑PDTC、1uM

6、PI3K抑制劑Wortmannin、10uM JAK抑制劑AG-490)和5uM泛素-蛋白酶體抑制劑MG132處理饑餓后的HK-2細(xì)胞24小時(shí)，通過Western blot檢測(cè)ABCG2蛋白表達(dá)水平。然后用0、1、10ng/ml IL-1β作用HK-2細(xì)胞24小時(shí)后通過Western blot分別檢測(cè)NF-κB亞基(P50、P52、P65)、AKT、JNK、ERK、JAK蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與MCF-7、HEK293、T47

7、D細(xì)胞相比，HK-2細(xì)胞中等量表達(dá)ABCG2。IL-1β直接作用于HK-2細(xì)胞可降低ABCG2的mRNA表達(dá)水平，其表達(dá)量隨濃度增加或時(shí)間延長(zhǎng)而降低，但蛋白表達(dá)升高，其蛋白定位無(wú)明顯遷移。IL-1β聯(lián)合TNF-α能進(jìn)一步增強(qiáng)HK-2細(xì)胞ABCG2蛋白表達(dá)水平，單獨(dú)用TNF-α、IL-10、TGF-β，以及IL-1β聯(lián)合IL-10或TGF-β無(wú)明顯影響。以PTDC阻斷NF-κB后抑制IL-1β誘導(dǎo)的ABCG2蛋白的表達(dá)，分別阻斷AKT、J

8、AK、JNK、ERK通路以及以MG132阻斷泛素-蛋白酶體水解通路后對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的ABCG2蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。進(jìn)一步檢測(cè)0、1、10ng/ml IL-1β刺激后的HK-2細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白中的JNK、ERK、NF-κB亞基(P65、P50、P52)、AKT、JAK表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與未加刺激的對(duì)照組比，P50和P65表達(dá)增強(qiáng)，胞漿表達(dá)量低于胞核，以1ng/ml IL-1β刺激后更高。P52、JNK、ERK、AKT、JAK無(wú)明顯改變。

9、r>　　結(jié)論:HK-2細(xì)胞中等量表達(dá)ABCG2。IL-1β可下調(diào)人腎近曲小管上皮細(xì)胞的ABCG2的mRNA表達(dá)，但增強(qiáng)HK-2細(xì)胞ABCG2蛋白表達(dá)水平。其蛋白定位無(wú)明顯遷移，這種表達(dá)增強(qiáng)的蛋白不通過泛素-蛋白酶體水解途徑降解或還經(jīng)過其他途徑作用。IL-1β聯(lián)合TNF-α能進(jìn)一步上調(diào)HK-2細(xì)胞ABCG2蛋白表達(dá)。IL-1β可能通過NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)ABCG2蛋白表達(dá)的上調(diào)，其中主要通過影響NF-κB亞基P50和P65的蛋白表達(dá)，