卵黃高磷蛋白在殼聚糖膜上誘導(dǎo)鈣離子礦化及作用機制研究.pdf

1、卵黃高磷蛋白是在雞蛋蛋黃中發(fā)現(xiàn)的一種酸性糖蛋白。由于該蛋白質(zhì)中含有大量絲氨酸，且大部分被磷酸化，這種結(jié)構(gòu)賦予卵黃高磷蛋白很強的乳化性、抗氧化性和與金屬離子結(jié)合的能力。本課題以卵黃高磷蛋白作為研究對象，探討了它在體外誘導(dǎo)、調(diào)控Ca2+礦化的作用。在此基礎(chǔ)上酶解蛋白得到卵黃高磷蛋白磷酸肽，研究了Ca2+與多肽的相互影響，并在細胞水平上開展了進一步研究。主要研究內(nèi)容和實驗結(jié)果如下:
　　(1)制備了殼聚糖及不同氧化石墨烯含量的殼聚糖復(fù)合

2、膜，并采用掃描電鏡、全反射紅外光譜和溶脹率測試檢測了復(fù)合膜的微觀形貌、二級結(jié)構(gòu)和溶脹性變化，將卵黃高磷蛋白作為誘導(dǎo)劑在復(fù)合膜上誘導(dǎo)模擬體液產(chǎn)生沉淀，沉淀用X射線衍射和掃描電鏡觀察。結(jié)果表明:氧化石墨烯會與殼聚糖發(fā)生共價結(jié)合，使殼聚糖膜表面變粗糙，橫截面出現(xiàn)多層復(fù)合結(jié)構(gòu)，溶脹性得到改善，復(fù)合膜溶脹率較殼聚糖膜降低27.90％。體外礦化結(jié)果表明:卵黃高磷蛋白能夠促進Ca2+在礦化過程中從無定型磷酸鈣向羥基磷灰石轉(zhuǎn)變;氧化石墨烯/殼聚糖膜模擬

3、體液中均產(chǎn)生了礦化沉淀。結(jié)論:氧化石墨烯可以改善殼聚糖膜性質(zhì)，卵黃高磷蛋白和氧化石墨烯均能促進模擬體液沉淀產(chǎn)生。
　　(2)研究制備了殼聚糖和氧化石墨烯/殼聚糖復(fù)合膜，并采用CCK-8法、AnnexinⅤ/PI雙染法和PI染色檢測了蛋黃中提取的卵黃高磷蛋白對MC3T3-E1細胞在該復(fù)合膜基質(zhì)上的生理活動的影響。結(jié)果表明:殼聚糖膜對細胞無毒性影響，并通過提高S期細胞所占比例從而使MC3T3-E1細胞活性提高了31.92％，同時，殼聚

4、糖還能抑制細胞凋亡，凋亡率下降52.48％;而氧化石墨烯/殼聚糖膜組細胞凋亡率較高，氧化石墨烯含量越高，促進凋亡越明顯，凋亡率在氧化石墨烯含量為2％時相比空白對照組上升11.31倍;在殼聚糖膜基質(zhì)上，100μg/mL卵黃高磷蛋白對MC3T3-E1細胞促進增殖作用最顯著，細胞活性提高81.59％,同時降低細胞的凋亡比例;蛋白濃度為500μg/mL時，細胞活性下降4.47％，促進細胞凋亡。結(jié)論分析，殼聚糖和低濃度卵黃高磷蛋白均能提高MC3T

5、3-E1細胞活性。
　　(3)為了進一步研究卵黃高磷蛋白與鈣離子相互作用的活性位點，針對卵黃高磷蛋白難以被水解的情況，聯(lián)合不同酶解技術(shù)制備得到不同水解度的卵黃高磷蛋白磷酸肽，并研究了磷酸肽與Ca2+的結(jié)合能力。對比發(fā)現(xiàn):采用處理劑和高溫高壓處理的卵黃高磷蛋白，其產(chǎn)物鈣螯合率為68.57％，比卵黃高磷蛋白提高了62.9％;另一方面，未經(jīng)預(yù)處理的卵黃高磷蛋白酶解10h后產(chǎn)物與鈣結(jié)合能力最高，為48.69％;與鈣結(jié)合后，蛋白和多肽的微觀