雞卵黃高磷蛋白中和內(nèi)毒素作用的研究.pdf

1、卵黃高磷蛋白(phosvitin，Pv)是卵黃蛋白原(vitellogenin，Vg)被卵母細(xì)胞吸收酶解后的主要產(chǎn)物之一，是一種富含磷酸化絲氨酸的具有兩親性的卵黃蛋白。研究表明，Pv具有螯合金屬離子的作用、乳化性、抗氧化性、抗凝血酶活性和免疫作用等多種功能性質(zhì)。本論文的目的是以雞Pv為材料，研究其在免疫調(diào)節(jié)方面的功能。
　　 本論文第一部分對(duì)Pv的殺菌活性及機(jī)理進(jìn)行研究。我們發(fā)現(xiàn)在50℃時(shí)Pv對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escher

2、ichia coli，E.coli)和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Saureus)的生長都有很強(qiáng)的抑制作用，但是37℃下Pv無顯著的殺菌作用。將異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的Pv與各種細(xì)菌孵育后用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Pv可以分別與E.coli和S.aureus結(jié)合。通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)發(fā)現(xiàn)Pv可以特異性地結(jié)合病原相關(guān)模式分子(pathogen-associatedmolecula

3、r patterns，PAMPs)如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)和肽聚糖(peptidoglycan，PGN)，并且結(jié)合呈現(xiàn)濃度依賴性，表明Pv是一種多價(jià)的模式識(shí)別受體。這些結(jié)果說明和魚類Pv一樣，雞Pv也可以與LPS、LTA和PGN等PAMPs結(jié)合，并且具有抗菌功能。然而，雞Pv的抗菌作用具有溫度依賴性。
　　 膿毒癥(sepsis)是由細(xì)菌感染

4、所引致的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)，常由外傷、手術(shù)以及燒燙傷等引發(fā)，是目前重癥監(jiān)護(hù)(intensive care units，ICU)病人高死亡率的主要原因，全球每年因膿毒癥死亡的病人高達(dá)100萬以上，死忘率高達(dá)40％-60％。LPS又稱內(nèi)毒素(endotoxin)，是膿毒癥的主要誘發(fā)因子，其靶細(xì)胞為單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，通過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)機(jī)體釋放腫瘤

5、壞死因子α(tumer necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)、白三烯(leukotriene，TL)、一氧化氮(nitric oxide，NO)等炎性因子，啟動(dòng)機(jī)體過度的、自我放大和自我破壞性的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，許多蛋白或肽類不僅具有抗菌作用，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以高親和性地結(jié)合LPS并從源頭上中和其毒性，從而降低對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，降低膿毒癥小鼠的死亡率

6、，避免器官損傷。因此，在本文第一部分發(fā)現(xiàn)Pv可以結(jié)合LPS的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了雞Pv中和內(nèi)毒素作用的研究。目前普遍認(rèn)為TNF-α是LPS毒性及膿毒癥癥狀的一個(gè)好的指示因子。因此，我們首先用LPS和Pv等處理小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，通過ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清的TNF-α的濃度來檢測(cè)Pv對(duì)LPS毒性的體外中和作用。我們發(fā)現(xiàn)Pv與LPS共同孵育的細(xì)胞釋放的TNF-α水平較LPS和生理鹽水共孵育組降低(p<0.05)，這表明Pv在體外

7、具有中和內(nèi)毒素的作用。MTT檢測(cè)和對(duì)紅細(xì)胞的溶血活性檢測(cè)表明，Pv不具細(xì)胞毒性或溶血活性，因此接下來我們又進(jìn)行了Pv中和內(nèi)毒素作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。作為第一步，我們建立了昆明小鼠膿毒癥模型，以便研究Pv對(duì)LPS毒性的體內(nèi)中和作用。通過腹腔注射不同劑量的LPS，最終選取致死率達(dá)80％-100％的50mg/kg的LPS劑量用作建立模型。在Pv對(duì)膿毒癥小鼠的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中，每組18只小鼠腹腔注射50 mg/kg LPS后隨即分別注射生理鹽水或Pv等

8、，發(fā)現(xiàn)Pv可延緩膿毒癥小鼠的死亡；模型對(duì)照組在16 h-24 h內(nèi)達(dá)到死亡高峰，死亡8只，而實(shí)驗(yàn)組小鼠在此時(shí)間段內(nèi)僅死亡1只；10 d內(nèi)實(shí)驗(yàn)組小鼠的存活率較模型對(duì)照組有所提高，尤其在LPS注射后24 h-64h期間Pv的保護(hù)作用顯著(p<0.05)。另外，通過ELISA檢測(cè)血清TNF-α濃度發(fā)現(xiàn)，Pv可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的小鼠血清TNF-α水平(p<0.01)。以上結(jié)果表明，在體內(nèi)Pv也具有中和內(nèi)毒素的作用。我們的研究表明Pv具有治療