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1、本文研究目的:采用一次性靜脈注射內(nèi)毒素復(fù)制肺損傷模型,觀察細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)在內(nèi)毒素肺損傷中的變化,探討內(nèi)毒素介導(dǎo)的肺損傷病理生理學(xué)機(jī)制,并進(jìn)一步揭示毒素清顆粒對(duì)內(nèi)毒素肺損傷保護(hù)作用的分子生物學(xué)機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 研究方法:健康雄性日本大耳白兔36只(n=36),隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、毒素清大劑量組、毒素清中劑量組、毒素清小劑量組,雙黃連對(duì)照組。各組6只。實(shí)驗(yàn)前1天、造模前2h及造模后30min,空白對(duì)照組和模型組
2、分別灌胃同等體積的生理鹽水,用藥組分別灌胃毒素清(5.04g·kg-1·d-1、2.52g·kg-1·d-1、1.26g·kg-1·d-1)、雙黃連(2.8ml·kg-1·d-1)。內(nèi)毒素肺損傷模型采用一次性耳緣靜脈注射精制大腸桿菌內(nèi)毒素(60μg/Kg)。造模后5小時(shí)取材。觀察家兔一般狀態(tài)、呼吸頻率,心率變化;發(fā)熱效應(yīng);外周血中中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞計(jì)數(shù);采用放射免疫法測(cè)定外周血清中細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(Tumornecrosisfact
3、or,TNF)-α、白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)、IL-6(Interleukin-6,IL-6)及IL-8(Interleukin-8,IL-8)水平以及支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavagefluid,BALF)中TNF-α、分泌型免疫球蛋白(Secretoryimmunoglobulin,sIgA)水平;采用黃嘌磷氧化酶法和TBA(硫代巴比妥酸)法分別測(cè)定肺泡灌洗液中超氧化物歧化酶(
4、SuperoxideDismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的水平;光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變;采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)肺組織中巨噬細(xì)胞、細(xì)胞間黏附分子-1(Intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(Vascularcelladhesionmolecule-1,VCAM-1)、IL-1和TNF-a的表達(dá)水平;采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎癥
5、蛋白-2(Macrophageinflammatoryprotein-2mRNA,MIP-2mRNA)表達(dá)水平。 研究結(jié)果:(1)靜注內(nèi)毒素后,模型組,毒素清組以及雙黃連對(duì)照組家兔體溫皆有上升,模型組最高,其最大發(fā)熱高度(△T)和體溫反應(yīng)指數(shù)(TemperatureResponseIndex,TRI)與空白對(duì)照組相比顯著增加(P<0.01)。毒素清中劑量組△T、TRI與模型組相比有顯著降低(P<0.05,P<0.01)。
6、 (2)模型組家兔在60、180、300min的心率(Heartrate,HR)呈進(jìn)行性上升,呼吸頻率(Respiratoryrate,RR)增快,在60min處達(dá)高峰。模型組與基礎(chǔ)值和空白對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較有顯著差異。與模型組同時(shí)點(diǎn)相比,毒素清組及雙黃連組在各時(shí)點(diǎn)均可不同程度的逆轉(zhuǎn)HR和RR的上升。而毒素清組和雙黃連組相比無顯著性差異。 (3)模型組外周血白細(xì)胞(Whitebloodcell,WBC)和中性粒細(xì)胞(Polymor
7、phonuclearleukocytes,PMN)計(jì)數(shù)在60min處開始明顯降低,與空白對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)相比差異顯著(P<0.01),且恢復(fù)緩慢,在實(shí)驗(yàn)5h仍低于實(shí)驗(yàn)前水平。毒素清組、雙黃連組計(jì)數(shù)變化趨勢(shì)介于空白對(duì)照組和模型組之間,能明顯逆轉(zhuǎn)WBC和PMN進(jìn)行性下降,而且毒素清大、中劑量組在實(shí)驗(yàn)后5h接近實(shí)驗(yàn)前的水平。 (4)與空白組相比,模型組肺含水量顯著增加(P<0.05),外周血清中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8水平
8、顯著升高(P<0.01),BALF中TNF-α和MDA水平升高(P<0.01)、sIgA水平降低(P<0.01),而毒素清組均能逆轉(zhuǎn)各項(xiàng)指標(biāo),大劑量和中劑量組作用更顯著。 (5)肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察可見,模型組家兔肺組織可見炎癥呈彌漫性的,支氣管周圍伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),管腔堵塞肺實(shí)變,肺泡隔增寬,肺間質(zhì)水腫,可見較多白細(xì)胞浸潤(rùn),局限性肺不張,毛細(xì)血管擴(kuò)張充血。毒素清組家兔肺部炎癥反應(yīng)明顯減輕。 (6)免疫組化結(jié)果顯示,
9、模型組CD68陽性細(xì)胞主要表達(dá)在肺血管、小支氣管周圍,肺泡及間質(zhì)散在出現(xiàn)。與空白對(duì)照組相比,模型組表達(dá)呈強(qiáng)陽性(P<0.01),毒素清各劑量組,雙黃連組與模型組相比表達(dá)顯著減低(P<0.01,P<0.05)。毒素清高劑量組較雙黃連組顯著降低(P<0.05)。 TNF-α免疫組化結(jié)果顯示,模型組以單核巨噬細(xì)胞的陽性表達(dá)為主,較空白對(duì)照組表達(dá)明顯增強(qiáng),(P<0.01),經(jīng)毒素清干預(yù)后,其表達(dá)較模型組明顯減弱(P<0.01),且毒素清
10、中劑量組較高劑量組和低劑量組有明顯差異(P<0.05,P<0.01),與雙黃連組相比無顯著性差異(P>0.05)。 IL-1陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi),模型組主要表達(dá)在支氣管上皮細(xì)胞,肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿內(nèi),呈強(qiáng)陽性。毒素清大劑量組,中劑量組較模型組表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01)。毒素清低劑量組和雙黃連組與模型組相比無顯著性差異。 ICAM-1免疫組化結(jié)果顯示,模型組家兔肺組織ICAM-1主要表達(dá)在支氣管
11、上皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞,較空白對(duì)照組表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)。毒素清各劑量組以及雙黃連組都較模型組表達(dá)顯著減低,高、中劑量組較雙黃連組表現(xiàn)明顯降低(P<0.05,P<0.01),中劑量組較低劑量組明顯降低(P<0.05)。 VCAM-1免疫組化結(jié)果顯示,模型組家兔肺組織中VCAM-1主要表達(dá)在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞,支氣管上皮細(xì)胞,都呈強(qiáng)陽性,在肺間質(zhì)也有大量表達(dá)。模型組較空白對(duì)照自表達(dá)顯著增強(qiáng),毒素清組和雙黃連組ICAM-1表達(dá)都
12、顯著減低,毒素清中劑量組與低劑量組相比顯著降低(P<0.05)。 (7)原位雜交結(jié)果顯示,在模型組家兔肺組織中,可見位于肺小動(dòng)、靜脈及細(xì)支氣管周圍,疏松結(jié)締組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞MIP-2mRNA表達(dá)陽性,定量結(jié)果顯示,模型組較空白對(duì)照組MIP-2mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01),毒素清大劑量組、小劑量組和中劑量組,較模型組表達(dá)顯著減低(P<0.05,P<0.01),毒素清中劑量較小劑量MIP-2mRNA表達(dá)顯著減低(P<0.05
13、),且毒素清中劑量作用較好。 研究結(jié)論: (1)通過一次性靜脈注射內(nèi)毒素可以成功復(fù)制大耳白兔的肺損傷模型,表現(xiàn)為家兔外周血炎性細(xì)胞急劇下降、肺含水量增加、肺臟病理?yè)p傷嚴(yán)重,其發(fā)生機(jī)制可能為肺組織中ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)上調(diào),PMN和血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascularendothelialcell,VEC)粘附增加,促進(jìn)了PMN在肺內(nèi)的集聚、扣押,進(jìn)而過度釋放炎性介質(zhì)和自由基。 (2)毒素清顆粒能夠?qū)箖?nèi)毒素
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