卵黃高磷蛋白的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及功能特性研究.pdf

1、卵黃高磷蛋白是雞蛋蛋黃中主要的磷蛋白，獨特的氨基酸組成和高度磷酸化使其具有很多優(yōu)良的物化和生物學(xué)特性，生物信息學(xué)分析推測卵黃高磷蛋白可能具有調(diào)控生物礦化的功能。本課題首先分離制備高純度的卵黃高磷蛋白，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，鑒定磷酸化位點并結(jié)合生物信息學(xué)分析，挖掘其潛在功能，最后研究卵黃高磷蛋白調(diào)控礦化的機(jī)制和活性位點。本課題為卵黃高磷蛋白在仿生礦化中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)建立一種條件溫和、高效簡單的分離卵

2、黃高磷蛋白的新方法，將雞蛋蛋黃依次經(jīng)等質(zhì)量蒸餾水和0.17mol/LNaCl稀釋離心除去蛋黃漿質(zhì)，獲得蛋黃顆粒，用10％1.74mol/LNaCl溶解后，添加3％w/wPEG6000并調(diào)整溶液pH至4.0，離心后透析凍干，制備的卵黃高磷蛋白(Pvti)電泳鑒定純度為99％，得率為47％。采用該方法分別從海蘭褐和白萊航雞蛋中分離制備卵黃高磷蛋白，HPLC測定純度分別達(dá)93.14％和91.80％，得率分別為63.93％和58.89％。進(jìn)一步

3、分析表明，這兩個品種中的卵黃高磷蛋白的含量、組成成分和二級構(gòu)象均無明顯差異，且與Sigma的一致。此外，使用離子交換層析法制備不含多價金屬離子的卵黃高磷蛋白，最佳條件為:Pvti經(jīng)Na2EDTA處理后，采用梯度增加NaCl濃度(0、0.35、0.5mol/L)的Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH7.5)在DEAE柱中洗脫，收集洗脫峰經(jīng)透析凍干，得到純化的不含多價金屬離子的卵黃高磷蛋白(Pvtf)。
　　(2)開展卵黃

4、高磷蛋白結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)分析，研究顯示卵黃高磷蛋白的氨基酸組成含有高達(dá)30％的絲氨酸(Ser)，富含酸性氨基酸(Asp、Glu)和堿性氨基酸(Arg、His)，含有極少量的芳香族氨基酸（Tyr、Cys、Trp）。使用紅外光譜(FTIR)和圓二色譜(CD)分析卵黃高磷蛋白二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)卷曲和β-折疊結(jié)構(gòu)，不含金屬離子的卵黃高磷蛋白β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增多。LC-ESI-MS/MS(LTQ)生物質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測分析表明卵黃高磷蛋白含有87個

5、磷酸化位點(83個P-Set和4個P-Thr)。利用生物信息學(xué)分析9個物種來源的11種卵黃高磷蛋白以及來源于人的5種磷酸化蛋白質(zhì)，進(jìn)行氨基酸組成、多序列比對和進(jìn)化樹分析，顯示均具有高絲氨酸含量，且富含酸性氨基酸的特點。雞卵黃高磷蛋白與牙本質(zhì)磷蛋白(DPP)的結(jié)構(gòu)及特性相似，進(jìn)化關(guān)系較近，意味著卵黃高磷蛋白可能具有與牙本質(zhì)磷蛋白相似的生物功能，即在生物礦化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　(3)利用鈣離子濃度計(ISE)、等溫滴定量熱

6、儀(ITC)、CD和熒光光譜方法，分別從化學(xué)、熱力學(xué)以及結(jié)構(gòu)信息方面，較為全面地研究了卵黃高磷蛋白與鈣離子的相互作用。在中性和弱堿性條件下，卵黃高磷蛋白與鈣離子相互作用存在高親和性和低親和性兩類結(jié)合位點。高親和性位點結(jié)合常數(shù)約為104mol-1，每摩爾卵黃高磷蛋白約結(jié)合30摩爾的鈣離子，該結(jié)合為焓驅(qū)動反應(yīng)，卵黃高磷蛋白的構(gòu)象變化為無序和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加，而β-折疊結(jié)構(gòu)減少，主要作用力為靜電、氫鍵或范德華力;而低親和性位點結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位

7、點數(shù)并不恒定，有大量的鈣離子累積在飽和鈣的分子或聚集區(qū)域的附近，該結(jié)合為熵驅(qū)動反應(yīng)，卵黃高磷蛋白的β-折疊結(jié)構(gòu)增加，主要作用力為疏水作用力;而在酸性條件下，卵黃高磷蛋白與鈣離子相互作用為熵驅(qū)動的吸熱反應(yīng)，主要作用力為弱的疏水相互作用。
　　(4)研究仿生礦化體系中卵黃高磷蛋白對磷酸鈣礦物晶相轉(zhuǎn)化的影響。FTIR、X射線衍射(XRD)、掃描電鏡(SEM)和能譜分析(EDS)表征礦物的結(jié)構(gòu)、組成以及表面微觀形貌，結(jié)果表明在該體系中生成

8、的磷酸鈣礦物通過“溶解再結(jié)晶”途徑從磷酸氫鈣(DCPD)轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基磷灰石(HAP)。卵黃高磷蛋白可以極大地促進(jìn)晶相轉(zhuǎn)化，使轉(zhuǎn)化過程由6h縮短至0.5h以內(nèi)。磷酸鈣礦物的FTIR和XRD圖譜顯示出蛋白質(zhì)特征峰，且礦化后濾液中蛋白含量降至原來的0.5％，表明卵黃高磷蛋白參與了磷酸鈣礦物的形成，成為礦物的組成部分之一。不同添加順序的實驗結(jié)果顯示，卵黃高磷蛋白在DCPD形成之前添加才能夠發(fā)揮其促進(jìn)作用，表明與游離鈣離子的互作是其調(diào)控磷酸鈣礦化的

9、關(guān)鍵。作為對照的BSA亦對晶相轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用，但其作用較弱且參與模式不同，BSA參與磷酸鈣礦物晶相轉(zhuǎn)化后期階段，而卵黃高磷蛋白參與晶相轉(zhuǎn)化起始階段，卵黃高磷蛋白在磷酸鈣礦化過程中的奇特作用與其高度的磷酸化密切相關(guān)。
　　(5)使用0.1、0.2、0.3、0.4mol/LNaOH溶液處理卵黃高磷蛋白(Pv)，經(jīng)超濾分離得到不同去磷酸化的卵黃高磷蛋白:T1、T2、T3和T4，去磷酸化程度分別為2.98％、19.46％、43.39％和

10、71.07％。并采用pH-stat體系研究了其對礦化的影響。卵黃高磷蛋白促進(jìn)礦化的效果呈濃度劑量關(guān)系。通過CD、FTIR、XRD、SEM和熒光光譜研究不同去磷酸化程度的卵黃高磷蛋白對礦化的影響，結(jié)果表明磷酸化在礦化反應(yīng)中起到很重要的作用。去磷酸化后的卵黃高磷蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)增加，可以提供礦化模板。去磷酸化程度低的卵黃高磷蛋白由于無序結(jié)構(gòu)減少，吸附礦物能力減弱，含磷量少，結(jié)合鈣離子能力減弱，從而促進(jìn)礦化效果減弱。但高濃度堿液處理卵黃高磷蛋

11、白使其水解為了卵黃高磷蛋白磷酸肽，由于活性區(qū)域暴露，成核位點增加，顯著的促進(jìn)礦化?？傊?，促進(jìn)礦化效果強弱順序依次為T4＞T3＞卵黃高磷蛋白＞T2＞T1＞Control。
　　(6)通過堿液部分去磷酸化后再用胰蛋白酶酶解卵黃高磷蛋白，經(jīng)DEAE離子交換色譜和SepharoseG-25凝膠過濾色譜分離純化卵黃高磷蛋白磷酸肽(PPP)各組分，SDS-PAGE和CD分析顯示PPP0和PPP1可能為卵黃高磷蛋白酶解的小分子片段（N端或C端）

12、，而PPP3和PPP4二級結(jié)構(gòu)相似，只是PPP4折疊更多，且PPP3多含10kDa的小分子肽。利用pH-stat體系研究卵黃高磷蛋白磷酸肽各組分對礦化效果的影響，通過CD、FTIR、XRD、SEM和熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)PPP0、PPP1、PPP4促進(jìn)效果并沒有卵黃高磷蛋白強，原因為PPP0和PPP1是小分子肽，不參與礦化;同時，PPP4折疊太多，結(jié)構(gòu)太緊湊，使得促進(jìn)礦化能力減弱。而PPP3暴露了活性區(qū)域，因此促進(jìn)效果最顯著。促進(jìn)礦化反應(yīng)效果