卵黃高磷蛋白對(duì)雞胚胎骨骼發(fā)育的影響.pdf

1、雞蛋中的卵黃高磷蛋白(phosvitin)是已知所有蛋白質(zhì)中磷酸化程度最高的蛋白質(zhì)，含磷量占蛋黃總磷量的80％，是雞胚骨骼發(fā)育中礦物質(zhì)磷的主要來(lái)源。本文以phosvitin作為研究對(duì)象，圍繞著phosvitin對(duì)雞胚胎骨骼發(fā)育的影響開(kāi)展了系列工作。主要研究?jī)?nèi)容和研究成果摘要如下:
　　研究了雞胚胎發(fā)育期間與骨骼發(fā)育相關(guān)指標(biāo)的變化規(guī)律。發(fā)現(xiàn)雞胚胎發(fā)育9-10d是一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn):蛋清pH在9d胚齡以后，逐漸趨于穩(wěn)定，保持在pH7.5左右;

2、蛋黃pH在10d胚齡時(shí)突然上升，達(dá)到最大值8.19，之后呈小幅度下降，在pH7.5附近相對(duì)穩(wěn)定;蛋黃總磷含量在10d胚齡時(shí)出現(xiàn)急劇下降，這與胚胎在9d胚齡開(kāi)始骨化有很大相關(guān)性。比較分析蛋黃磷含量的降低速率、堿性磷酸酶活力變化以及雞胚體長(zhǎng)的增長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)三者的變化趨勢(shì)基本一致，先上升后下降。在14-16d總磷下降速率最快，平均達(dá)到0.027mg/g.d，ALP活力也達(dá)到最大值1.12U/gprot，體長(zhǎng)增長(zhǎng)率的變化有一定滯后，在17d胚齡增長(zhǎng)率

3、達(dá)到最大，1.17cm/d，這與蛋黃中的磷被轉(zhuǎn)移到胚胎然后被胚胎骨骼發(fā)育利用需要一定時(shí)間有關(guān)。
　　研究了胚胎發(fā)育的9-20d phosvitin的變化。變性凝膠電泳和非變性凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)了胚胎發(fā)育期間phosvitin分子量逐漸下降，磷氮比的測(cè)定結(jié)果和對(duì)紅外原始圖譜的分析都證明了孵化期間phosvitin磷酸根含量下降，通過(guò)紅外光譜和圓二色譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)phosvitin二級(jí)結(jié)構(gòu)在孵化期間γ-無(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)

4、向α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)化，phosvitin向有序性變化。綜合分析P/N比、二級(jí)結(jié)構(gòu)、與上一章中的ALP、體長(zhǎng)增長(zhǎng)率，這些指標(biāo)的變化最快最高的階段在時(shí)間和區(qū)間上都表現(xiàn)出一致性，在13-16d胚齡phosvitin的磷酸根含量降低最明顯，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有序性增強(qiáng)，γ-無(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)向α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)化，堿性磷酸酶、雞胚體長(zhǎng)大幅度的增加。證明了在phosvitin與雞胚骨骼發(fā)育密切相關(guān)，并且是通過(guò)脫磷酸化提供雞胚骨骼形成需要的磷。

5、
　　研究了0、50、100、500、1000μg/mL phosvitin處理MC3T3-E1細(xì)胞24h、48h后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響。CCK-8法檢測(cè)phosvitin對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活力的影響，流式細(xì)胞儀法分析了phosvitin對(duì)細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明:低濃度蛋白可以促進(jìn)增殖，抑制細(xì)胞凋亡;高濃度蛋白會(huì)抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。phosvitin濃度100μg/mL時(shí)效果最好。100μg/mL ph

6、osvitin處理MC3T3-E1細(xì)胞48h后:細(xì)胞增殖活力達(dá)到108.61％，細(xì)胞增殖率達(dá)到23.49％，顯著高于對(duì)照組及高濃度組;細(xì)胞正在凋亡率為6.42％，已經(jīng)凋亡率為2.47％，顯著低于對(duì)照組和高濃度組。
　　研究了空白、Pv、Pv+Vc、Pv+β-GP、Vc+β-GP5種礦化誘導(dǎo)劑對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響。實(shí)驗(yàn)首先確立誘導(dǎo)礦化實(shí)驗(yàn)中最佳接種密度為1×104/cm2。對(duì)誘導(dǎo)礦化期間細(xì)胞內(nèi)ALP活力、礦化結(jié)節(jié)含量以及

7、相關(guān)基因表達(dá)量結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)phosvitin單獨(dú)誘導(dǎo)不能引起細(xì)胞礦化但是可以促進(jìn)細(xì)胞成骨活動(dòng)，21d時(shí)ALP活力達(dá)到1.0U/gprot，顯著高于陰性對(duì)照組，并且顯著上調(diào)Col-ⅠmRNA、OCN mRNA的表達(dá)，對(duì)Runx-2 mRNA、BMP-2 mRNA表達(dá)量的影響較弱，茜素紅染色結(jié)果呈陰性。Pv+β-GP組可以誘導(dǎo)礦化，21d時(shí)ALP活力達(dá)到2.1U/gprot，稍低于陽(yáng)性對(duì)照組，對(duì)Runx-2 mRNA、BMP-2 mRNA、