魚類卵黃高磷蛋白衍生多肽中和LPS作用及紅景天苷抗炎作用機理的研究.pdf

1、脂多糖lipopolysaccharide(LPS)又稱為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性細胞細胞壁的重要組成部分，是一種高度保守的病原相關(guān)分子模式pathogen-associatedmolecular parttems（PAMPs）。LPS可以通過誘導(dǎo)促炎因子的上調(diào)表達進而引發(fā)宿主細胞的炎癥反應(yīng)。炎癥因子的過量表達最終會導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生，嚴(yán)重時可導(dǎo)致宿主死亡。由于目前臨床上還沒有治療LPS引起的膿毒癥特效藥物，因此，尋找可以阻止LPS對宿主先天

2、性免疫反應(yīng)的激活的新型試劑是非常必要與急切的。在本研究中，鑒定出兩種潛在的內(nèi)毒素中和劑-Pt5和紅景天苷，并且探討了它們的作用機制。
　　卵黃蛋白原的功能在早期一直被認為在胚胎發(fā)育提供中提供營養(yǎng)物質(zhì)，我們在近期的研究中發(fā)現(xiàn)它還有免疫功能。卵黃高磷蛋白是卵黃蛋白原降解衍生蛋白質(zhì)之一。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)重組的斑馬魚卵黃高磷蛋白具有一定的LPS中和作用，它可以結(jié)合病原相關(guān)分子模式LPS、脂磷壁酸（LTA）和肽聚糖(PGN)，并有著一定的

3、抑菌功能。為了尋找卵黃高磷蛋白的抑菌活性中心，在之前的研究中采用氨基端截短表達的方法，發(fā)現(xiàn)羧基端的55個氨基酸(Pt5)殘基仍有一定的免疫活性。本研究對Pt5進行了LPS中和活性的研究。對Pt5進行了定點突變，找出了比Pt5具有更高抑菌活性的多肽Pt5e，并確定了Pt5e與Pt5一樣具有廣譜的抑菌活性，在較低的濃度下即可抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的生長。通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)證明重組Pt5可以與LPS和LTA結(jié)合。為了驗

4、證將來Pt5e能否應(yīng)用于人類疾病上，我們使用MTT和溶血實驗，驗證了Pt5e對小鼠巨噬細胞（RAW264.7）不具有細胞毒性并且對人類血紅細胞不具有溶血活性。使用LPS和Pt5e處理RAW264.7，通過ELISA檢測細胞上清的炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量，發(fā)現(xiàn)Pt5e可以顯著降低這兩種炎癥因子水平。接下來，將LPS和Pt5e腹腔注射到小鼠體內(nèi)，一定時間后檢測小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-1β的濃度發(fā)現(xiàn)Pt5e也顯著降低了

5、血清中這兩種炎癥因子濃度，說明Pt5e具有體內(nèi)和體外中和LPS的功能。在使用半致死實驗驗證Pt5e是否對膿毒癥小鼠起到保護作用的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)Pt5e有效的提高膿毒癥小鼠的存活率(p＜0.05)。體內(nèi)試驗表明在腹腔同時注射LPS和Pt5e的小鼠組其抑制膿毒癥的能力顯著高于僅注射LPS的對照小鼠組。本研究表明Pt5e不僅可以抑制病原菌的生長，還具有LPS中和作用，這一發(fā)現(xiàn)有助于新型的臨床抗膿毒癥藥物的開發(fā)。
　　紅景天苷是一種存在

6、于紅景天植物根莖中的葡萄糖苷。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)本實驗結(jié)果表明在中，紅景天苷可以促進老齡大鼠的免疫應(yīng)答，提高其抗氧化能力，從而發(fā)揮其抗衰老的作用。本研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷可以抑制LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。紅景天苷可以有效地抑制炎癥因子Ⅱ類反式激活因子(CⅡTA)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、一氧化氮合酶(iNOS)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥相關(guān)因子的表達。為了解析紅景天苷抑

7、制LPS誘發(fā)炎癥反應(yīng)的機制，我們檢測了三條已報道的可被LPS誘發(fā)的炎癥通路(MAPK、JAK-STAT和PI3-K-Akt信號通路)中部分關(guān)鍵因子的蛋白表達水平和磷酸化水平。該實驗結(jié)果表明紅景天苷可以顯著降低PI3-K-Akt通路中的Akt磷酸化水平和NF-κB通路中的NF-κB磷酸化水平(p＜0.05)，而對MAPK和JAK-STAT中的關(guān)鍵因子并沒有影響。與此相一致，通過抑制PI3-K-Akt通路中的上游因子PI3-K后發(fā)現(xiàn)，紅景天