殼聚糖-海藻酸鈣復(fù)合敷料影響血小板活性及黏附的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　前期開發(fā)了殼聚糖/海藻酸鈣復(fù)合敷料，對大體動(dòng)物股動(dòng)脈出血顯示出良好的止血作用，有望為臨床手術(shù)或應(yīng)急現(xiàn)場救援提供一種有效的動(dòng)脈止血敷料，但其凝血機(jī)制尚未清楚。血小板黏附是血小板發(fā)揮生理功能的初始步驟，因而促進(jìn)血小板黏附對于生物活性材料發(fā)揮止血作用具有重要意義。本課題探討該復(fù)合敷料對血小板活性及黏附的影響及作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組:空白對照組（Control）;殼聚糖組

2、(CS);海藻酸鈣組(Alg-Ca);殼聚糖/海藻酸鈣復(fù)合敷料組(CS/Alg-Ca);
　　2.分步離心法制備濃縮血小板血漿;
　　3.掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）結(jié)合乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的含量測定考察血小板黏附情況;
　　4.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測P-選擇素(P-Selectin，CD62p)和整合素(CD61)的表達(dá);

3、
　　5.采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測血漿中血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)含量;
　　6.實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)檢測血小板中與血小板聚集和黏附等功能相關(guān)的CD63、Yes1、Pafah1b2、Pecam1、Lamp1、CD4

4、0Lg基因表達(dá);
　　7.熒光分光光度法檢測血漿中ATP和血小板內(nèi)游離鈣離子含量。
　　結(jié)果:
　　1.SEM結(jié)合LDH檢測結(jié)果:CS組黏附血小板數(shù)量少，但偽足伸展呈激活狀態(tài); Alg-Ca組黏附血小板數(shù)量多，但多呈圓形未激活狀態(tài);CS/Alg-Ca組黏附血小板數(shù)量多且呈激活狀態(tài)。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果
　　與Control組相比，CS組血小板膜蛋白CD62p水平無明顯變化，Alg-Ca組和CS/Al

5、g-Ca組CD62p水平均顯著升高。
　　與Control組相比，CS組CD61有所升高，Alg-Ca組CD61有所下降，CS/Alg-Ca組CD61與CS組水平基本一致。
　　3.ELISA檢測TXB2含量發(fā)現(xiàn)CS/Alg-Ca復(fù)合敷料能夠提高血漿中TXB2含量(P＜0.05)。
　　4.qPCR檢測結(jié)果
　　CS組CD63表達(dá)水平升高(P＜0.05)，CS下調(diào)Yes1、Pecam1、CD40Lg的基因水平(P

6、＜0.05)，而顯著上調(diào)Lamp1的基因水平(P＜0.05)。
　　Alg-Ca下調(diào)CD63、Yes1、Pecam1、CD40Lg的基因水平(P＜0.05)，但可以上調(diào)Pafah1b2基因水平(P＜0.05)。
　　CS/Alg-Ca復(fù)合物與Alg-Ca相比能夠上調(diào)CD63基因的表達(dá)(P＜0.05)，下調(diào)Yes1、Pecam1的基因水平(P＜0.05)，與CS和Alg-Ca相比，能上調(diào)CD40Lg的基因水平(P＜0.05)。

7、
　　5.熒光探針檢測血漿中ATP和細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子含量發(fā)現(xiàn)CS/Alg-Ca并不能提高血漿中ATP含量和游離鈣離子含量。
　　結(jié)論:
　　1.CS/Alg-Ca具有較好的血小板黏附作用，此作用與黏附早期Alg-Ca升高CD62p表達(dá)和黏附中后期升高CD61表達(dá)有關(guān)。
　　2.CS/Alg-Ca復(fù)合敷料能夠提高PRP中TXB2含量。
　　3.CS/Alg-Ca復(fù)合敷料對CD63黏附基因的表達(dá)量相對Alg-C