HepLL細(xì)胞海藻酸-殼聚糖微囊包裹和凍存研究.pdf

1、獲得足夠數(shù)量具有高度活性及良好功能的肝細(xì)胞是生物人工肝(Bioarfificialljver-BAL)發(fā)揮功能和肝細(xì)胞移植(Hepatocyte transplantation,HCT)獲得成功的關(guān)鍵.眾所周知,正常人肝細(xì)胞來源有限,且在宿主體內(nèi)增殖較弱;而胎肝細(xì)胞、腫瘤源性肝細(xì)胞由于致瘤性風(fēng)險和倫理學(xué)原因,也難以在臨床推廣應(yīng)用.為此本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)通過SV40LTag轉(zhuǎn)染正常成人原位肝移植的供肝細(xì)胞,建立了一株永生化人源性肝細(xì)胞HepLL

2、,在體外可以無限傳代.一系列鑒定結(jié)果表明它具有和人原代培養(yǎng)肝細(xì)胞類似的形態(tài)學(xué)特征,保持了大部分正常肝細(xì)胞的生物學(xué)活性.將該永生化HepLL肝細(xì)胞進(jìn)行BALB/C裸鼠移植的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,脾內(nèi)移植的HcpLL細(xì)胞參與和促進(jìn)了部分肝切除裸鼠的肝臟再生.前期的工作證實(shí)HepLL細(xì)胞可在體內(nèi)外發(fā)揮良好的特異性肝細(xì)胞功能,有應(yīng)用于生物人工肝和肝細(xì)胞移植的前景;但必須解決體外大規(guī)模培養(yǎng)和保存運(yùn)輸?shù)葐栴}.普通的單層貼壁培養(yǎng)為二維平面培養(yǎng),限制了大規(guī)模的

3、擴(kuò)增和長時間細(xì)胞功能的發(fā)揮,且其凍存和收獲用于生物人工肝和肝細(xì)胞移植較為復(fù)雜困難.微囊培養(yǎng)為三維空間培養(yǎng),是進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增的良好手段,也是建立生物人工肝和肝細(xì)胞移植所需肝細(xì)胞庫的潛在培養(yǎng)方法,同時為大規(guī)模凍存和運(yùn)輸提供了便捷的手段.因此,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了HepLL細(xì)胞海藻酸一殼聚糖(AC)微囊包裹和短期培養(yǎng)的研究,并對AC微囊化HepLL細(xì)胞的凍存保護(hù)液配方進(jìn)行了初步的探索. 方法: 1.一步法和兩步法海藻酸-殼聚糖(A

4、C)微囊包裹HepLL細(xì)胞,MTT法檢測包裹后7天兩者的活力,以確定適合HepLL細(xì)胞AC包裹的方法. 2. 以單層貼壁的HepLL細(xì)胞為對照組,每天以MTT、Ki-67免疫組化染色檢測一步法AC微囊包裹HepLL細(xì)胞活力和增殖活性,激光共聚焦顯微鏡、HE染色觀察其形態(tài)學(xué)特征至第10天;以兩天為間隔檢測其白蛋白、尿素合成、安定轉(zhuǎn)化等肝細(xì)胞特異性功能至第10天,評價AC微囊包裹HepLL細(xì)胞能否在微囊內(nèi)發(fā)揮良好的生物學(xué)活性.

5、 3.分別用含海藻糖的凍存保護(hù)液和不含海藻糖的凍存保護(hù)液凍存一步法AC微囊包裹后6天的HepLL細(xì)胞,-80℃凍存14天后復(fù)蘇,MTT法檢測其復(fù)蘇后當(dāng)天、第7天的增殖活性,檢測復(fù)蘇后第7天白蛋白合成能力和安定轉(zhuǎn)化能力,以探索AC微囊化HepLL細(xì)胞凍存液的較佳配方. 結(jié)果: 1.一步法海藻酸-殼聚糖(AC)包裹后7天的HepLL細(xì)胞比兩步法包裹的活力更強(qiáng); 2. 一步法AC微囊包裹的HepLL細(xì)胞在微

6、囊內(nèi)能存活并均勻分布,至第10天細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki-67表達(dá)仍較強(qiáng);和單層貼壁的細(xì)胞相比一步法AC微囊包裹的HepLL細(xì)胞包裹后8天至10天,其活力、合成能力、和生物轉(zhuǎn)化能力更強(qiáng); 3.復(fù)蘇后當(dāng)天、第7天,海藻糖組微囊化HepLL細(xì)胞活力比對照組微囊化HepLL細(xì)胞更強(qiáng),復(fù)蘇后第7天其白蛋白合成能力比對照組強(qiáng).以上結(jié)果顯示一步法AC微囊包裹的HepLL細(xì)胞能在微囊內(nèi)存活、增殖,和單層貼壁的相比,較長時間培養(yǎng)活力更高、功能更強(qiáng),是