黃連素通過PXR信號(hào)通路調(diào)控CYP3A和P-gp的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.探討鹽酸黃連素(Berberine chloride，BBR)是否通過PXR信號(hào)通路調(diào)控CYP3A和P-糖蛋白(P-glycolprotein，P-gp)的表達(dá)。
　　2.探討B(tài)BR通過哪些方式和途徑促進(jìn)環(huán)孢素A (CyclosporineA，CsA)血藥濃度的升高，尋找BBR對(duì)CYP3A和P-gp作用的途徑。
　　3.將BBR與PXR和CAR核受體聯(lián)系起來，進(jìn)一步探討B(tài)BR對(duì)CsA增效的機(jī)制。

2、　　方法：
　　1.RNAi慢病毒載體構(gòu)建
　　參照Addgene公司pLKO.1、pMD2.G、psPAX2質(zhì)粒使用方法。對(duì)含pLKO.1、pMD2.G、psPAX2質(zhì)粒的菌液進(jìn)行培養(yǎng)、提取、鑒定。對(duì)pLKO.1質(zhì)粒進(jìn)行酶切，膠回收線形載體。人工合成的2條特異性干擾PXR的shRNA片段分別與線形載體進(jìn)行連接后，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，挑取培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行培養(yǎng)和篩選、測(cè)序。
　　2.沉默PXR的細(xì)胞構(gòu)建
　　根據(jù)測(cè)序

3、結(jié)果，選擇構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒進(jìn)行純化提取。采用慢病毒包裝系統(tǒng)，將重組pLKO.1、psPAX2和pMD2.G質(zhì)粒按一定比例導(dǎo)入293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，收集攜帶有干擾片段shRNA的慢病毒上清液，將其感染HepG2細(xì)胞，產(chǎn)生siRNA，特異性抑制PXR基因的表達(dá)，從而構(gòu)建沉默PXR的細(xì)胞株。Western-blot檢測(cè)感染細(xì)胞PXR、CYP3A4、P-gp的蛋白表達(dá)，根據(jù)PXR蛋白水平的表達(dá)判斷構(gòu)建的細(xì)胞是否被沉默。若構(gòu)建成功，考察沉

4、默細(xì)胞CYP3A4和P-gp蛋白表達(dá)的變化。
　　3.蛋白表達(dá)水平
　　提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法定量后，調(diào)整樣品蛋白濃度，經(jīng)蛋白變性后進(jìn)行western-blot檢測(cè)細(xì)胞的PXR、CYP3A4和P-gp蛋白表達(dá)水平。采用Imagine J軟件對(duì)各條帶光密度值進(jìn)行檢測(cè)，以此對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　4.基因表達(dá)水平
　　細(xì)胞處理48h后，提取細(xì)胞的mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進(jìn)行RTQ-P

5、CR反應(yīng)，檢測(cè)PXR、 CYP3A4和P-gp(MDR1)的mRNA表達(dá)水平，根據(jù)各基因相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct的計(jì)算方法，對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法
　　數(shù)據(jù)采用SPSS20.0進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，P值取雙側(cè)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.通過酶切鑒定三種質(zhì)粒分別為pLKO.1、pMD2.G、psPAX2，對(duì)重組pLKO.1

6、質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，人工合成的2條PXR-shRNA片段均成功導(dǎo)入pLKO.1質(zhì)粒。
　　2.在未沉默細(xì)胞與沉默細(xì)胞中，沉默組細(xì)胞PXR的蛋白表達(dá)顯著低于未沉默組細(xì)胞(P＜0.01)，成功構(gòu)建了沉默PXR的細(xì)胞株，分別命名為PXRi19#、PXRi21#。PXRi21#的PXR蛋白表達(dá)顯著低于PXRi19#(P＜0.05)，表明PXRi21#的沉默效率更高，選擇PXRi21#作為沉默組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。PXRi21#細(xì)胞中，CYP3A4

7、和P-gp的蛋白表達(dá)與HepG2細(xì)胞和PXRi對(duì)照組細(xì)胞無明顯差異(P＞0.05)。
　　3.在HepG2細(xì)胞和PXRi21#細(xì)胞中，CYP3A4和P-gp蛋白表達(dá)隨著BBR濃度的增大而減少，當(dāng)BBR給藥劑量為40μg/ml時(shí)，PXRi21#細(xì)胞的CYP3A4和P-gp蛋白表達(dá)均顯著高于HepG2細(xì)胞(P＜0.01)。
　　4.在HepG2細(xì)胞和PXRi21#細(xì)胞中，CYP3A4和MDR1 mRNA表達(dá)隨著BBR濃度的增大而

8、減少，當(dāng)BBR給藥劑量為10μg/ml時(shí)，PXRi21#細(xì)胞的CYP3A4和MDR1 mRNA表達(dá)顯著高于HepG2細(xì)胞(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了pLKO.1-PXR-siRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，獲得PXR沉默的細(xì)胞株。
　　2.沉默細(xì)胞中CYP3A4和P-GP的蛋白表達(dá)與未沉默細(xì)胞比較無明顯差異，表明在HepG2細(xì)胞中，CYP3A4和P-gp的蛋白表達(dá)不僅僅與PXR通路相關(guān)。
　　3.BB