高脂日糧誘導(dǎo)團(tuán)頭魴脂肪肝發(fā)生機(jī)制及黃連素調(diào)控的研究.pdf

1、近年來(lái)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，集約化養(yǎng)殖，高密度養(yǎng)殖，飼料營(yíng)養(yǎng)不均衡，過(guò)飽食投喂等原因，往往導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)脂肪代謝的障礙與紊亂。而脂肪肝是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)比較容易出現(xiàn)的問(wèn)題，病魚(yú)生長(zhǎng)速度緩慢、餌料系數(shù)變大、抗病能力降低、高溫季節(jié)還會(huì)大量死亡等。因此，探討?hù)~(yú)類(lèi)脂肪肝發(fā)生機(jī)制，尋找緩解或預(yù)防脂肪代謝障礙的方法對(duì)魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖具有重要生產(chǎn)意義。本試驗(yàn)通過(guò)高脂誘導(dǎo)團(tuán)頭魴脂肪肝，探討比較正常和脂肪肝病變團(tuán)頭魴的脂肪代謝途徑的差異，對(duì)團(tuán)頭魴肝臟脂肪過(guò)度沉積機(jī)制做了初

2、步的研究，并用營(yíng)養(yǎng)學(xué)方法干預(yù)脂肪肝的發(fā)生。試驗(yàn)內(nèi)容分為六部分:
　　1.高脂誘導(dǎo)團(tuán)頭魴營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝模型的建立
　　本試驗(yàn)通過(guò)投喂3種不同脂肪水平（5％、10％和15％）飼料誘導(dǎo)團(tuán)頭魴肝臟細(xì)胞脂肪變性，以建立團(tuán)頭魴營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?種不同飼料在室內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)養(yǎng)殖15g左右的團(tuán)頭魴6周，并于養(yǎng)殖試驗(yàn)的第3、4、5和6周采樣，進(jìn)行肝臟病理組織學(xué)觀察和血清學(xué)測(cè)定。結(jié)果表明經(jīng)過(guò)6周養(yǎng)殖試驗(yàn)脂肪水平為15％的飼料能誘導(dǎo)團(tuán)頭魴產(chǎn)生較

3、為嚴(yán)重的脂肪肝病癥，光鏡下可以發(fā)現(xiàn)肝臟組織空泡化嚴(yán)重，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)肝臟細(xì)胞中有大量的脂滴出現(xiàn)、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;同時(shí)血液AST、ALT含量顯著升高，提示肝臟受到損傷;血脂含量也顯著升高。本試驗(yàn)表明通過(guò)投喂團(tuán)頭魴高脂日糧(15％)能夠使其產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝，該模型具備脂肪肝的病理特征。
　　2.高脂日糧對(duì)團(tuán)頭魴免疫、氧化應(yīng)激及肝細(xì)胞凋亡的影響
　　本試驗(yàn)旨在探討高脂日糧對(duì)團(tuán)頭魴非特異性免疫、肝功能及肝細(xì)胞凋亡的影響;試驗(yàn)用5％

4、（對(duì)照組）與15％（高脂組）脂肪水平的日糧分別投喂團(tuán)頭魴8周后，測(cè)定生長(zhǎng)性能、非特異性免疫、氧化應(yīng)激及肝細(xì)胞凋亡指標(biāo)。結(jié)果表明團(tuán)頭魴攝食高脂日糧8周之后，肝臟脂肪堆積嚴(yán)重，增重率顯著降低，血漿溶菌酶、補(bǔ)體活性及球蛋白等非特異性免疫活性降低，肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化嚴(yán)重;用細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)方法測(cè)定肝細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示肝細(xì)胞凋亡顯著增多，且凋亡細(xì)胞集中于中央靜脈及空泡化嚴(yán)重部位;用RT-PCR方法檢測(cè)了肝細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物基因表達(dá)，結(jié)果顯示復(fù)

5、合物Ⅰ與Ⅲ基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，另外線粒體琥珀酸脫氫酶及鈉鉀ATP酶活性均顯著低于對(duì)照組，這表明線粒體的功能失調(diào)，透射電鏡也表明線粒體的超微結(jié)構(gòu)受損?？傊?，本試驗(yàn)表明團(tuán)頭魴肝臟脂肪過(guò)度沉積后，肝臟容易遭受氧化損傷、肝細(xì)胞凋亡增加，而這可能與線粒體的功能失調(diào)與結(jié)構(gòu)損傷有關(guān);此外，還會(huì)導(dǎo)致團(tuán)頭魴非特異性免疫下降。
　　3.高脂日糧對(duì)團(tuán)頭魴肝臟脂肪分泌、脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)及脂肪沉積的影響
　　本試驗(yàn)旨在探討團(tuán)頭魴肝臟脂肪過(guò)度沉積的生理機(jī)

6、制，為防止養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的脂肪肝病變提供參考。用脂肪水平為5％和15％的日糧分別投喂團(tuán)頭魴8周后采樣，進(jìn)行生理學(xué)及生物化學(xué)分析。采用腹腔注射Poloxamer407法測(cè)定肝臟向外輸出脂肪能力，分析脂蛋白組分變化以考察脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)，并考查了脂蛋白酯酶活性及基因表達(dá)。結(jié)果表明，團(tuán)頭魴攝食高脂日糧后肝臟超微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，肝臟細(xì)胞內(nèi)沉積大量脂滴，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。高脂組，肝臟分泌甘油三酯能力與血漿中極低密度脂蛋白含量顯著降低;同

7、時(shí)脂蛋白組分與正常組比較顯著不同;肝臟、腹脂及肌肉中多不飽和脂肪含量顯著升高，而飽和及單不飽與脂肪酸含量顯著降低;各組織脂蛋白酯酶活性及mRNA表達(dá)顯著升高，肝臟PPARα mRNA表達(dá)顯著降低，而PPARγ mRNA表達(dá)顯著升高。本試驗(yàn)結(jié)果表明團(tuán)頭魴攝食高脂日糧后，肝臟向外分泌脂肪能力的下降、脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改變以及肝臟攝取脂肪能力的增強(qiáng)是造成團(tuán)頭魴肝臟脂肪過(guò)度沉積的主要原因。
　　4.高脂日糧對(duì)團(tuán)頭魴肝臟脂肪酸β-氧化的影響

8、r>　　試驗(yàn)用脂肪水平為5％和15％的日糧分別投喂團(tuán)頭魴8周后采樣，進(jìn)行生理學(xué)及生物化學(xué)分析?？疾楦闻K脂肪酸β-氧化能力及限速酶調(diào)控的變化。結(jié)果顯示:團(tuán)頭魴攝食高脂日糧后，肝臟超微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，肝臟細(xì)胞內(nèi)沉積大量脂滴，線粒體等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;肝臟脂肪酸β-氧化能力顯著降低;同時(shí)ACO及CPTⅠ兩個(gè)關(guān)鍵酶活性顯著下降;除此之外，CPTⅠ對(duì)底物的親和力及催化效率顯著降低;ACO及CPTⅠ基因表達(dá)量顯著降低;線粒體膜脂肪酸組成，兩

9、組間存在顯著差異，且高脂組線粒體代謝能力減弱。本試驗(yàn)結(jié)果表明:團(tuán)頭魴攝食高脂日糧后，肝臟脂肪酸β-氧化能力下降，而ACO及CPTⅠ活性劑催化效率的降低是其下降的主要原因，而其基因表達(dá)及構(gòu)象的變化是β-氧化能力下降的最終原因。
　　5.團(tuán)頭魴C(jī)PTⅠ基因cDNA克隆及表達(dá)特征分析
　　試驗(yàn)采用RACE技術(shù)克隆了團(tuán)頭魴肉堿酰基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(CPTⅠ)基因全長(zhǎng)的cDNA序列，并研究了不同組織中的CPTⅠmRNA表達(dá)量及饑餓對(duì)肝臟、心臟

10、和肌肉CPTⅠ與PPARs mRNA表達(dá)的影響?？寺〉玫降膱F(tuán)頭魴C(jī)PTⅠ基因的cDNA序列全長(zhǎng)為2499 bp，含有1個(gè)長(zhǎng)度為2181 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼726個(gè)氨基酸。經(jīng)預(yù)測(cè)，其分子量為82950.8，等電點(diǎn)為8.99，并且有3段跨膜區(qū)域。序列分析表明，團(tuán)頭魴C(jī)PTⅠ基因包含一個(gè)CPTⅠ特有的保守結(jié)構(gòu)域。此外，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了心臟、肌肉、肝臟等10個(gè)組織中CPTⅠ基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示表達(dá)量最高的兩個(gè)組織為心臟和肌肉，次之

11、為腸、肝臟與腦，脾、眼與鰓表達(dá)量最低。此外，饑餓顯著影響團(tuán)頭魴肌肉、肝臟與心臟CPTⅠ與PPARα的表達(dá)，CPTⅠ表達(dá)量呈現(xiàn)下降后升高的趨勢(shì)，團(tuán)頭魴攝食后CPTⅠ表達(dá)量略有下降，但在12-24h CPTⅠ表達(dá)量顯著的增加，而在72h時(shí)表達(dá)量又顯著的降低。PPARα呈現(xiàn)先升高有下降到的趨勢(shì)，2-12h階段表達(dá)量一直呈升高趨勢(shì)，12-72h階段呈顯著降低的趨勢(shì)。而PPARβ與PPARγ的表達(dá)量變化不大。
　　6.黃連素對(duì)攝食高脂日糧團(tuán)

12、頭魴脂肪代謝的影響
　　試驗(yàn)用5％脂肪、15％脂肪及15％脂肪分別添加50與100 mg/kg黃連素投喂團(tuán)頭魴8周，考查團(tuán)頭魴肝臟脂肪沉積狀況，脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)及肝細(xì)胞凋亡等指標(biāo)。結(jié)果表明黃連素可以緩解團(tuán)頭魴肝臟的氧化損傷，降低肝細(xì)胞的凋亡率;對(duì)線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃連素可以提高復(fù)合物Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的活性，透射電鏡結(jié)果表明黃連素可以減少脂肪在肝臟中的沉積、改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的超微結(jié)構(gòu);用RT-PCR檢測(cè)了與脂肪