鹽酸小檗堿對高脂飲食誘導(dǎo)的SD大鼠非酒精性脂肪肝的療效及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過高脂飼料誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease NAFLD)Sprague-Dawley(SD)大鼠動物模型，觀察鹽酸小檗堿對非酒精性脂肪肝的治療效果；并篩選NAFLD異常表達(dá)的脂代謝相關(guān)基因，及其與脂代謝紊亂的關(guān)系，從表觀遺傳學(xué)探討基因表達(dá)異常的機(jī)制及鹽酸小檗堿的作用機(jī)制。
　　方法：
　　6周齡SD大鼠，隨機(jī)分為正常飲食組、高脂飲食組，給予相應(yīng)飲食飼養(yǎng)

2、8周，高脂飲食飼養(yǎng)組大鼠經(jīng)肝臟病理切片確認(rèn)為NAFLD模型成功后，高脂飲食組再次隨機(jī)分為鹽酸小檗堿(Berberine，BBR)干預(yù)組及溶劑對照組。給予相應(yīng)藥物連續(xù)灌胃16周，藥物治療期間每周測體重，計算進(jìn)食情況，每月測空腹血糖、胰島素、甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(Cholestorel，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(Low densitylipoprotein cholestorel，LDL-c)、高密度脂蛋白膽

3、固醇(High density lipoproteincholestorel，HDL-c)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，藥物干預(yù)第16周末行腹腔內(nèi)糖耐量實(shí)驗(yàn)(Intraperitoneal glucose tolerancetest，IPGTT)，第二天處死，收集血及組織標(biāo)本，肝組織行冰凍切片蘇丹Ⅲ脂肪染色及肝臟勻漿測TG含量。提取三組肝臟RNA，采用real-time PCR對

4、脂代謝關(guān)鍵基因進(jìn)行定量檢測mRNA水平。肝臟組織提取DNA，進(jìn)行亞硫酸鹽處理，采用PCR產(chǎn)物測序及亞克隆/測序方法對real-time PCR定量檢測出正常飲食對照組與高脂飲食對照組表達(dá)差異的基因啟動子區(qū)域進(jìn)行DNA甲基化程度。采用快速蛋白液相色譜(Fast protein liquidchromatography，F(xiàn)PLC)分析了血清脂蛋白成分的變化。
　　結(jié)果：
　　高脂飲食飼養(yǎng)8周能誘導(dǎo)SD大鼠肝臟脂質(zhì)沉積，成功建立N

5、AFLD模型。BBR干預(yù)16周能明顯減輕NAFLD大鼠體重、內(nèi)臟脂肪總量及肝臟的濕重，改善脂代謝紊亂，從病理組織學(xué)及提取肝臟TG含量的結(jié)果表明BBR能改善高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝，并且改善胰島素敏感性。高脂飲食對照組大鼠肝臟存在脂代謝相關(guān)基因如微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MTTP)、低密度脂蛋白受體(LDLR)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT1α)及硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(SCD-1)的表達(dá)異常，且BBR能夠糾正這些基因的表達(dá)異常及增加血清VLDL-

6、TG水平。對這些基因的表達(dá)改變的機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明高脂飲食飼養(yǎng)大鼠肝臟MTTP啟動子區(qū)域平均甲基化水平和5個CpG位點(diǎn)中的3個(-174，-113及-20)甲基化程度顯著高于正常飲食對照組。并且BBR顯著減低這些CpG位點(diǎn)的甲基化程度(最多至30％)。相關(guān)性分析結(jié)果表明-113和-20CpG位點(diǎn)的甲基化程度與MTTP mRNA水平呈顯著負(fù)相關(guān)。這些研究結(jié)果提示高脂飲食導(dǎo)致肝臟MTTP基因啟動子區(qū)域高度甲基化，影響MTTP的轉(zhuǎn)錄，從而

7、引起MTTP mRNA水平的下降。另外，選定調(diào)控LDLR和CPT-1α轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵啟動子區(qū)域序列CpG位點(diǎn)沒有觀察甲基化的修飾，推測LDLR和CPT-1α的表達(dá)調(diào)控可能受到其他機(jī)制的影響如組蛋白修飾等。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)SD大鼠脂肪肝及改善胰島素敏感性。進(jìn)一步研究表明，鹽酸小檗堿能夠逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD大鼠肝臟脂代謝關(guān)鍵基因MTTP、LDLR、CPT-1α及SCD-1的表達(dá)異常有關(guān)