16個氨基酸多肽對高脂飲食+CCl4誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝的保護性作用及機制研究.pdf

1、目的:肝臟疾病是一個巨大的全球性公共衛(wèi)生問題，長期肝損傷無法獲得及時有效的治療將最終發(fā)展為肝衰竭或肝癌，顯著降低病人生存質(zhì)量甚至直接威脅生命。隨著社會的進(jìn)步，人類生活品質(zhì)的顯著提高，脂肪性肝病已躍升為第二大高發(fā)性肝病，僅次于病毒性肝炎，嚴(yán)重威脅著人類的健康。究其原因，快節(jié)奏的現(xiàn)代化生活以及不良的飲食習(xí)慣影響巨大。高脂飲食+CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型是一個較為理想的慢性脂肪性肝病大鼠模型，用來模擬人因不良飲食習(xí)慣導(dǎo)致的慢性脂肪性肝病。<

2、br>　　為尋找早期肝炎臨床診斷的生物標(biāo)志物，本室前期運用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)從慢性肝炎病人血清中檢測到的一個含量較高的多肽，即16個氨基酸多肽片段。經(jīng)體外培養(yǎng)的細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)該多肽高表達(dá)可改變HepG2細(xì)胞的增殖周期，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。
　　迄今為止，尚無關(guān)于該多肽在慢性脂肪性肝病動物模型中生理、病理以及作用機制的研究。依據(jù)本室前期研究成果已證實該多肽針對靜脈注射Con A誘導(dǎo)的急性肝損傷

3、小鼠模型具有保護作用，推測其可能在慢性脂肪性肝病進(jìn)展中同樣發(fā)揮保護作用，故進(jìn)行本研究。本研究利用高脂飲食+CCl4誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪肝模型研究該16個氨基酸多肽片段在非酒精性脂肪肝病中的治療作用，并初步探討其作用機制，為下一步臨床肝病治療提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、16個氨基酸多肽片段治療性給藥對大鼠慢性脂肪性肝損傷的作用將56只雄性SD大鼠隨機分為7組，除正常組分別在相應(yīng)給藥時點通過腹腔注射給予生理鹽水并普通飼

4、料進(jìn)食外，其余各組大鼠均通過腹腔注射給予CCl4溶液每3天1次（3ml/kg），高脂飲食喂養(yǎng)，持續(xù)4周。將已分好組并完成慢性脂肪性肝損傷模型建立的56只大鼠，除正常組分別在相應(yīng)給藥時點通過尾靜脈注射給予生理鹽水外，其余各組大鼠分別經(jīng)灌胃給予復(fù)方甘草酸苷稀釋液(120mg/kg)，降脂通絡(luò)軟膠囊稀釋液(80mg/kg)或經(jīng)尾靜脈注射給予200、400、800μg/kg體重16個氨基酸多肽，每3天1次，持續(xù)治療6周后，處死動物。收集大鼠血液

5、，分離血清，采用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST、TBIL、TG及CHOL水平。通過血清學(xué)指標(biāo)觀察該多肽治療性給藥對高脂飲食+ CCl4誘導(dǎo)肝損傷的影響。
　　2、肝組織病理學(xué)檢測
　　治療性給藥結(jié)束后處死動物，分離肝臟，分別于同一位置切取適當(dāng)大小的肝組織進(jìn)行固定，石蠟包埋，行5μm連續(xù)切片后進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)，并采集圖像。
　　3、肝組織蘇丹黑B脂肪特殊染色
　　制作冰凍切片

6、取組織時應(yīng)注意不能太大太厚，大小為24×24×2mm左右為宜。行6-10μm切片后進(jìn)行蘇丹黑B染色，觀察組織病理學(xué)形態(tài)，并采集圖像。
　　4、肝組織MCP-1表達(dá)水平的測定
　　應(yīng)用免疫組化方法檢測肝組織MCP-1蛋白表達(dá)水平，通過多功能真彩色細(xì)胞圖像管理系統(tǒng)軟件，捕獲由顯微鏡采集的組織圖片，選取其中陽性表達(dá)最強的5個視野進(jìn)行計算，得出陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞顯色強度，從而得出免疫組化評分(IHS)的數(shù)值。探討該多肽治療性給藥對

7、高脂飲食+ CCl4誘導(dǎo)肝損傷的作用機制。
　　5、肝細(xì)胞脂肪變性程度與MCP-1蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析
　　肝組織MCP-1蛋白表達(dá)水平在不同程度肝細(xì)胞脂肪變性中存在差異，通過HE染色觀察到的肝細(xì)胞脂肪變性程度與MCP-1蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析，分析不同程度肝細(xì)胞脂肪性變性對MCP-1蛋白表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步證實該多肽片段對肝臟保護作用的機制。
　　結(jié)果:
　　1、16個氨基酸多肽片段治療性給藥對高脂飲食

8、+CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷的影響
　　多肽片段200μg/kg組、800μg/kg組、西藥組、中藥組及正常組血清ALT水平均顯著低于模型組（P＜0.05）;多肽片段200μg/kg組、800μg/kg組及正常組血清AST水平均顯著低于模型組（P＜0.05），且多肽片段800μg/kg組血清AST水平顯著低于西藥組（P＜0.05）;各組血清TBIL水平均無明顯差異;多肽片段200μg/kg組、400μg/kg組、800μg/kg組血

9、清CHOL水平均顯著低于模型組(P＜0.01)，其中多肽片段400μg/kg組、800μg/kg組血清CHOL水平均顯著低于西藥組（P＜0.01）;多肽片段200μg/kg組、西藥組、中藥組及正常組血清TG水平均顯著低于模型組(P＜0.01)，多肽片段400μg/kg組、800μg/kg組血清TG水平與模型組無明顯差異。
　　2、肝組織病理學(xué)檢測
　　病理切片顯示，模型組大鼠肝組織中出現(xiàn)大片脂肪空泡，西藥對照組治療性給藥顯著

10、改善肝細(xì)胞脂肪空泡情況。各劑量多肽片段組與中藥組亦減輕了高脂飲食+ CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷，較模型組肝細(xì)胞脂肪空泡數(shù)量明顯減少。
　　3、肝組織蘇丹黑B脂肪特殊染色
　　結(jié)果顯示，模型組中央靜脈和匯管區(qū)可見片狀黑色點狀脂肪顆粒;多肽片段200μg/kg組、400μg/kg組、中藥組和西藥組黑色脂肪顆粒較模型組相對減少;多肽片段800μg/kg黑色脂肪顆粒相較模型組顯著減少。
　　4、16個氨基酸多肽片段治療性給藥對肝

11、組織MCP-1蛋白表達(dá)的影響
　　免疫組化結(jié)果顯示，西藥組、中藥組、多肽片段200μg/kg組、400μg/kg組和800μg/kg組MCP-1表達(dá)免疫組化總評分與模型組和正常組均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);多肽片段各劑量組、西藥陽性藥物組和中藥陽性藥物組MCP-1表達(dá)免疫組化總評分之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　5、肝細(xì)胞脂肪變性程度與MCP-1蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析
　　肝細(xì)胞脂肪變性程度與MCP-

12、1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.642，P＜0.01。并且肝細(xì)胞脂肪變性陽性細(xì)胞數(shù)越多，其肝組織MCP-1蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)也越多，相關(guān)系數(shù)r=0.566，P＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1、外源性給予16個氨基酸多肽片段不僅能夠降低脂肪肝大鼠血清ALT、AST、CHOL、TG水平，還能夠減少肝臟空泡樣變，使肝細(xì)胞恢復(fù)正常，可有效治療高脂飲食+ CCl4誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝。
　　2、外源性給予16個氨